轉(zhuǎn)染SEA基因的肝癌-樹突狀細胞融合瘤苗的體外抗腫瘤研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見的腫瘤之一，每年發(fā)生的肝癌約占全世界40％，居惡性腫瘤死亡率的第2位。肝癌對放化療都不敏感，目前主要采用以手術(shù)治療為主的綜合治療，但肝癌根治性切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍居高不下。腫瘤生物治療能夠激發(fā)機體免疫功能，殺傷臨床上難以發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞，有助于防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此尋找有效的生物治療方法，對防治肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要意義。葡萄球菌腸毒素A(Staph

2、ylococcalenterotoxinA，SEA)是一種具有很強的激活T細胞能力的細菌性超抗原，能夠通過激活免疫細胞，產(chǎn)生多種細胞因子和超抗原依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(Superantigendependentcellmediatedcytotoxi--city，SDCC)殺傷腫瘤細胞。但是單用SEA進行免疫治療會引起一系列全身毒性反應(yīng)。轉(zhuǎn)染SEA基因的腫瘤瘤苗能提高腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)機體局部和全身的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而有效控制腫瘤生

3、長，但無法提高T細胞的腫瘤特異性殺傷能力。樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)是機體免疫系統(tǒng)中已知的功能最強的專職抗原遞呈細胞(ant--igenpresentingcell，APC)，能有效激活T細胞，引起特異性免疫反應(yīng)。DCs與腫瘤細胞的融合瘤苗是一種新型的DC疫苗，既表達MHCⅠ、Ⅱ類分子及CD80、CD86、CD54等共刺激分子，又能內(nèi)源性表達腫瘤特異抗原及腫瘤相關(guān)抗原。但單用腫瘤細胞DC融合瘤苗還不能非常有效地抑

4、制腫瘤在動物體內(nèi)的生長，腫瘤DC融合瘤苗的免疫刺激能力有待提高。本研究室已經(jīng)成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)染SEA基因的BEL-7402肝癌細胞(簡稱SEA-肝癌細胞)，并已證明SEA-肝癌細胞在體外培養(yǎng)能夠分泌SEA，比普通BEL-7402肝癌細胞(簡稱肝癌細胞)更能誘導(dǎo)提高T細胞的腫瘤殺傷能力。我們設(shè)想在此基礎(chǔ)上，將SEA-肝癌細胞與臍血來源的DCs進行融合，制備SEA-肝癌DC融合瘤苗，一方面增強肝癌細胞免疫原性；另一方面增強腫瘤抗原遞呈能力，提高

5、SEA作用的特異性，減少應(yīng)用SEA產(chǎn)生的副作用。 目的：本研究擬在已構(gòu)建的SEA-肝癌細胞基礎(chǔ)上，采用細胞融合技術(shù)，將SEA-肝癌細胞與臍血來源的DCs進行融合，制備SEA-肝癌DC融合瘤苗，檢測其在體外刺激同源細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokineinducedkiller，CIK)對肝癌細胞的殺傷作用。尋求整合發(fā)揮SEA高效激活免疫細胞能力和DC融合瘤苗激發(fā)免疫細胞特異性抗腫瘤作用優(yōu)點的腫瘤生物治療方法。 方法：1

6、)用免疫組化方法檢測SEA-肝癌細胞中SEA蛋白的表達。2)流式細胞儀檢測SEA-肝癌細胞和肝癌細胞表面抗原呈遞相關(guān)分子的表達。3)從臍血中分離單個核細胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs，通過細胞形態(tài)學(xué)和檢測細胞表面分子表達情況進行鑒定。4)分離并培養(yǎng)誘導(dǎo)CIK細胞。5)用PEG法融合DCs和SEA-肝癌細胞或肝癌細胞，制備SEA-肝癌DC融合瘤苗，并以肝癌DC融合瘤苗作為對照。6)兩種DC融合瘤苗分別與CIK細胞共培養(yǎng)72h，用MTT法檢測SEA-肝

7、癌DC融合瘤苗、肝癌DC融合瘤苗激活的CIK細胞對肝癌細胞的殺傷能力，對結(jié)果進行對比分析。 結(jié)果：1)轉(zhuǎn)染SEA基因的SEA-肝癌細胞高表達SEA蛋白，而肝癌細胞不表達SEA蛋白。2)肝癌細胞和SEA-肝癌細胞均高表達HLA-ABC、CD54，低表達CD80、CD86和HLA-DR；SEA-肝癌細胞表面CD54的陽性率高于肝癌細胞。3)從臍血中培養(yǎng)誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)的DCs，流式細胞儀檢測DCs表面分子陽性率分別為：HLA-AB

8、C(98.86±0.95％)，HLA-DR(65.03±12.52％)，CD1a(54.76±29.16％)，CD54(88.09±7.11％)，CD80(85.03±8.69％)，CD86(89.67±12.51％)，CD83(58.22±14.24％)。4)培養(yǎng)1、7、14、21天的CIK細胞中CD3+CD56+細胞的比例分別為16.4％、37.7％、49.2％、69.7％。5)兩種DC融合瘤苗激活的CIK細胞對肝癌細胞的殺傷率均高

9、于DCs和肝癌細胞共培養(yǎng)激活的CIK細胞；SEA-肝癌DC融合瘤苗激活的CIK細胞對肝癌細胞的殺傷效率高于肝癌DC融合瘤苗激活的CIK細胞。 結(jié)論：1)SEA-肝癌細胞經(jīng)過多次凍存復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，仍能夠穩(wěn)定表達SEA蛋白。2)肝癌細胞和SEA-肝癌細胞表面高表達HLA-ABC、CD54，低表達HLA-DR和CD80、CD86。SEA-肝癌細胞表面CD54表達水平高于肝癌細胞。3)用臍血單核細胞能培養(yǎng)誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)的成熟DCs