腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞瘤苗聯(lián)合射頻消融治療實體瘤的動物實驗研究.pdf

1、射頻消融(RadiofrequencyAblation，RFA)治療是局部熱療的一種，其通過電極激發(fā)鄰近組織中的離子運(yùn)動并產(chǎn)生大量的離子熱，從而導(dǎo)致局部的高溫和凝固性壞死，近年，RFA被廣泛地應(yīng)用于肝內(nèi)腫瘤的治療并在小肝癌取得了與手術(shù)切除相當(dāng)?shù)慕诤椭羞h(yuǎn)期療效，且RFA具備創(chuàng)傷小，副作用小和重復(fù)性好的特點(diǎn)，但術(shù)后復(fù)發(fā)及治療不完全導(dǎo)致的腫瘤殘存仍是影響其療效和臨床應(yīng)用的主要原因，因此，在RFA治療中進(jìn)一步激發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的主動免疫反應(yīng)

2、，有可能在延緩腫瘤生長、殺滅體內(nèi)微小殘留病灶或轉(zhuǎn)移病灶，防止術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面起重要作用。 以樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)瘤苗為代表的生物治療是近年腫瘤治療的另一熱點(diǎn)。由于DC具有強(qiáng)大的外來抗原識別、攝取和遞呈的能力，能激活機(jī)體抗腫瘤的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和刺激B淋巴細(xì)胞使其產(chǎn)生特異性抗體，因此，DC在機(jī)體抗腫瘤免疫中起著必不可少的作用。 然而DC在體內(nèi)的含量甚微，且大量的研究表明，腫瘤細(xì)胞通過干擾

3、DC的正常分化、成熟，或通過一些可溶性因子導(dǎo)致DC表面的MHC—Ⅰ、MHC—Ⅱ類分子或共刺激分子的表達(dá)及功能受抑制，使其不能正常識別和提呈腫瘤抗原，從而不能激發(fā)有效的機(jī)體抗腫瘤免疫方應(yīng)，腫瘤因而可以“逃避”機(jī)體的免疫機(jī)制得以生長。 本研究擬在應(yīng)用RFA治療腫瘤后聯(lián)合應(yīng)用熱休克凍融抗原致敏DC瘤苗或凍融抗原致敏DC瘤苗回輸至荷瘤機(jī)體，探討聯(lián)合治療的療效及對機(jī)體免疫狀態(tài)的影響，以討論其臨床應(yīng)用的可能性。 研究目的

4、 1．在RFA治療后，利用負(fù)載不同抗原的DC瘤苗治療大鼠實體瘤，探討經(jīng)不同處理腫瘤抗原致敏DC聯(lián)合RFA治療對療效的影響。 2．通過檢測治療前后大鼠外周血中CD4+T胞和CD8+T細(xì)胞水平及CD4+／CD8+比值的變化，探討負(fù)載不同抗原DC瘤苗聯(lián)合RFA治療大鼠實體瘤對大鼠免疫機(jī)能的影響。 材料與方法 一、實驗采用動物、細(xì)胞株及主要試劑同第一部分，射頻儀采用：Radionics單極冷循環(huán)射頻治療儀

5、。超聲儀：百勝Technos DU8彩色多普勒超聲儀。 二、動物模型的建立：80-100 g體重的SD大鼠經(jīng)腹腔接種walker 256細(xì)胞懸液后5-7天可獲腹水型Wlalker 256腫瘤模型(種鼠)；SD大鼠腋窩經(jīng)皮下接種Walker 256腫瘤腹水，5天后可獲大鼠實體瘤腫瘤模型(實驗鼠)。 三、大鼠骨髓來源DC的分離、培養(yǎng)與鑒定、抗原的制備及DC疫苗的制備方法同第一章。 四、實驗方法：

6、 1．實驗分組：58只成瘤大鼠隨機(jī)分成5組： ①單純射頻組，n=10：僅接受射頻消融治療； ②單純熱休克凍融抗原致敏DC組，n=10：僅接受熱休克凍融抗原致敏的DC治療； ③射頻+未致敏DC組，n=10：射頻治療后，聯(lián)合未致敏DC治療； ④射頻+凍融抗原致敏DC組，n=10：射頻治療后，聯(lián)合凍融抗原致敏．DC治療； ⑤射頻+熱休克凍融抗原致敏DC刺激組，n=18：射頻治療后，

7、聯(lián)合熱休克凍融抗原致敏DC治療； 2．實驗方法： (1)射頻治療：超聲引導(dǎo)下以裸露端20 mm電極沿病灶長軸穿刺，射頻輸出功率60 W，治療時間2 min。 (2)免疫治療：收集未致敏或不同抗原致敏的DC，射頻治療后在腫瘤附近皮下接種不同的DC瘤苗，注射細(xì)胞數(shù)為1.0×10<'6>個，單純射頻組在腫瘤附近同樣方法皮下注射等量生理鹽水。 五、療效觀察 1．治療前及治療后第1、2、3天

8、行超聲檢查，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，并在各組間進(jìn)行比較。記錄各組大鼠荷瘤生存期，繪制生存曲線。 2．大鼠免疫機(jī)能檢測：治療前、后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測大鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞水平，并計算CD4+／CD8+比值。 3．治療后取右側(cè)腋窩腫瘤，行常規(guī)HE染色病理檢查。 結(jié)果 1．動物模型：腹水型Walker 256大鼠模型成瘤率80％(16／20)， Walker 256大鼠實體瘤成瘤

9、率92.9％(65／70)。 2．腫瘤大小及生長：治療前各組的實體瘤體積大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后第1、2、3天測量熱休克凍融抗原致敏DC組平均瘤體體積均顯著小于其他組(P<0.05)，單純射頻組、單純熱休克凍融抗原致敏DC治療組及射頻+未致敏DC組平均瘤體體積間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，射頻+凍融抗原致敏DC組在治療后第1天平均瘤體體積與單純射頻組、單純熱休克凍融DC治療組及射頻+未致敏DC組無顯著差異，但在治療后第

10、2、3天測得平均瘤體體積顯著小于后3組(P<0.05)。 3．大鼠荷瘤生存期：平均荷瘤生存期：單純射頻組：9.0±1.4 d，熱休克凍融抗原致敏DC治療組：9.04±1.7 d，射頻+未致敏DC組：9.1±1.8 d，射頻+凍融抗原致敏DC組：13.1±2.8 d，射頻+熱休克凍融抗原致敏DC組：16.6±5.4 d。射頻+熱休克凍融抗原致敏DC組和射頻+凍融抗原致敏DC組大鼠荷瘤生存期顯著長于其他3組(P<0.05)，而前者

11、的大鼠荷瘤生存期又較后者的明顯延長(P<0.05)，其他3組的大鼠荷瘤生存期無明顯差異(P>0.05)。 4．病理學(xué)檢查：HE染色，光鏡下觀察可見：各組均可見腫瘤內(nèi)部局部壞死，腫瘤組織內(nèi)可見較多炎癥細(xì)胞浸潤，其中射頻+熱休克凍融抗原致敏DC組和射頻+凍融抗原致敏DC組可見腫瘤內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤。 5．大鼠的免疫狀態(tài)：各組大鼠治療前后CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+／CD8+比值如下： (1)單純射頻

12、組：治療后荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞增加，CD8+T淋巴細(xì)胞減少，CD4+／CD8+比值升高，免疫狀態(tài)有所改善。 (2)單純熱休克凍融抗原致敏DC組：大鼠治療后其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和D8+T淋巴細(xì)胞均呈下降改變，CD4+／CD8+比值降低，免疫抑制狀態(tài)仍然繼續(xù)。 (3)射頻+未致敏DC組：荷瘤大鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞均呈下降改變，CD4+／CD8+比值降低，免疫抑制狀態(tài)沒有得到改

13、善。 (4)射頻+凍融抗原致敏DC組：荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞增加，而CD8+T淋巴細(xì)胞減少，CD4+／CD8+比值明顯升高。 (5)射頻+熱休克凍融抗原致敏DC組：荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞明顯增加，而CD8+T淋巴細(xì)胞顯著減少，CD4+／CD8+比值明顯升高。 (6)治療前后各組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞的差值：射頻+熱休克凍融致敏DC組中CD4+T細(xì)胞的升高與其他四組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(

14、P＜0.05)；射頻+凍融抗原致敏DC組其CD4+T細(xì)胞的升高較①、②、③三組比明顯，與單純射頻組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與后兩組比差異顯著(P＜0.05)?！　?(7)治療前后各組大鼠外周血CD8+T細(xì)胞的差值：治療后各組荷瘤大鼠外周血中CD8+T細(xì)胞均呈下降改變，其中，下降的幅度南大到小依次為：射頻+熱休克凍融抗原致敏DC組＞射頻+凍融抗原致敏DC組＞單純射頻組＞單純熱休克凍融抗原致敏DC組或射頻+未致敏DC組(P＜0.05

15、) (8)治療前后各組大鼠外周血CD4+/CD8+比值的差值：射頻+熱休克凍融致敏DC組＞射頻+凍融抗原致敏DC組或單純射頻組＞單純熱休克凍融致敏DC組或射頻+未致敏DC組(P＜0.05)。 結(jié)論 1．Walker 256細(xì)胞株接種大鼠腹腔及腋下可以獲得腹水型和實體瘤型大鼠腫瘤模型，操作簡便，成癌率高，保存方便，為研究提供了方便可用的動物模型。 2．熱休克凍融抗原致敏DC和凍融抗原致敏DC聯(lián)合RF

16、A治療大鼠實體瘤，可在一定程度上減緩腫瘤生長速度，延長荷瘤大鼠生存期，其中以熱休克凍融抗原致敏DC+RFA的效果為佳。 3．熱休克凍融抗原致敏DC和凍融抗原致敏DC聯(lián)合RFA治療可使荷瘤大鼠外周血CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值升高，使CD8+T細(xì)胞下降，在一定程度上改善了機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)了機(jī)體的抗腫瘤免疫機(jī)能，有望在治療RFA殘存腫瘤和預(yù)防治療后復(fù)發(fā)上發(fā)揮一定作用，其中以熱休克凍融抗原致敏DC+RFA的作用明顯

17、。 全文結(jié)論 1．經(jīng)體外誘導(dǎo)分化大鼠骨髓造血干細(xì)胞可以成功地獲得大鼠DC，熱休克凍融抗原及凍融抗原致敏DC后可以誘導(dǎo)DC成熟，并有效地刺激T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)出特異性的細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)，以熱休克處理后腫瘤抗原致敏DC明顯。 2．熱休克凍融抗原致敏DC和凍融抗原致敏DC聯(lián)合RFA治療大鼠實體瘤，可在一定程度上減緩腫瘤生長速度，延長荷瘤大鼠生存期，其中以熱休克凍融抗原致敏DC+RFA的效果為佳。 3．熱休克