肝干細(xì)胞作為肝細(xì)胞癌靶向基因治療載體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源標(biāo)記基因的工程化肝干細(xì)胞，在體外共培養(yǎng)體系及動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中觀察標(biāo)記肝干細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的定向趨向能力，初步探討以肝干細(xì)胞作為肝細(xì)胞癌靶向基因治療載體的可行性。 方法：1.采用細(xì)菌同源重組法構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因腺病毒載體pAd-CMV-EGFP，在人胚腎293細(xì)胞中包裝制備腺病毒，并用重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的大鼠肝干細(xì)胞WB-F344，觀察腺病毒攜帶的外源基因EGFP在WB-F34

2、4細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)肝干細(xì)胞的感染效率。單克隆培養(yǎng)純化建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株(WB-EGFP)，并采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)以觀察其生物學(xué)特性。2.利用重組腺病毒介導(dǎo)EGFP在大鼠肝干細(xì)胞WB-F344和原代培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞中表達(dá)，建立工程化穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肝干細(xì)胞WB-EGFP、大鼠胚胎成纖維細(xì)胞REF-EGFP。在相互隔離的條件下，共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞CBRH7919和肝干細(xì)胞WB-EGFP或成纖維細(xì)胞REF

3、-EGFP，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察肝干細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中遷移的生物學(xué)行為，以探討肝干細(xì)胞是否有趨向肝癌細(xì)胞的特性。3.將肝癌細(xì)胞CBRH7919在免疫抑制的Wistar大鼠肝臟原位注射，建立大鼠肝癌原位動(dòng)物模型，從尾靜脈注射EGFP標(biāo)記的肝干細(xì)胞，不同時(shí)點(diǎn)取大鼠肝癌、癌旁肝組織、正常肝組織、脾臟、腎臟以及肺臟組織標(biāo)本，動(dòng)態(tài)追蹤肝干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移，并用免疫組織化學(xué)染色證實(shí)c-kit陽(yáng)性細(xì)胞的分布。免疫組織化學(xué)染色法，分析SDF-1、c-kit在正

4、常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)差異。進(jìn)一步，經(jīng)門靜脈、肝動(dòng)脈、尾靜脈、癌旁肝組織等四種不同的途徑移植肝干細(xì)胞，觀察分析不同移植途徑對(duì)肝干細(xì)胞趨向肝癌及肝癌組織內(nèi)定植、增殖能力的影響。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建腺病毒載體，包裝制備出高滴度的重組腺病毒Ad-EGFP。重組腺病毒能有效感染肝干細(xì)胞WB-F344，感染率約40～70％。單克隆培養(yǎng)建立WB-EGFP細(xì)胞株，觀察直觀，連續(xù)傳代8～9代均較穩(wěn)定表達(dá)EGFP及肝干細(xì)胞表面標(biāo)記，仍保持干細(xì)

5、胞樣的增殖、分化等基本生物學(xué)特性。2.成功建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP的大鼠肝干細(xì)胞(WB-EGFP)、胚胎成纖維細(xì)胞(REF-EGFP)。在肝干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，觀察到隔離區(qū)細(xì)胞爬片上培養(yǎng)的WB-EGFP細(xì)胞緩慢向肝癌細(xì)胞CBRH7919生長(zhǎng)區(qū)移動(dòng)，不僅發(fā)生在中央隔離空白區(qū)接種的WB-EGFP細(xì)胞，而且最邊緣空白區(qū)接種的WB-EGFP細(xì)胞也有類似的定向遷移；而胚胎成纖維細(xì)胞無(wú)趨向肝癌細(xì)胞遷移的現(xiàn)象，72小時(shí)后仍大部分停留在蓋玻片上。

6、兩種細(xì)胞向肝癌細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞數(shù)量有明顯差異(P＜0.01)。3.建立大鼠肝癌模型，經(jīng)尾靜脈移植分子標(biāo)記的肝干細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)肝癌組織邊緣出現(xiàn)明顯的綠色熒光細(xì)胞環(huán)繞，熒光細(xì)胞逐漸擴(kuò)散到肝癌組織中，甚至到達(dá)腫瘤中央?yún)^(qū)域。而癌旁肝組織、對(duì)照組正常肝臟、脾臟、腎臟以及肺臟中，均無(wú)明確的熒光細(xì)胞分布。免疫組化分析，肝癌組織中c-kit陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(P＜0.001)，SDF-1表達(dá)與正常肝組織比較無(wú)明顯升高(P＞0.05)，肝干細(xì)胞這種定

7、向遠(yuǎn)距離遷移至腫瘤的分子機(jī)理與趨化因子SDF-1的表達(dá)可能無(wú)確切相關(guān)關(guān)系。不同移植途徑對(duì)肝干細(xì)胞的體內(nèi)分布有影響，四種移植途徑中，門靜脈途徑更有利于肝干細(xì)胞定向遷移至肝癌瘤床，并迅速在腫瘤組織中定植、增殖(P＜0.05)，部分替代并整和腫瘤組織。同時(shí)肝干細(xì)胞在體內(nèi)仍穩(wěn)定表達(dá)外源標(biāo)記基因產(chǎn)物。 結(jié)論：利用重組腺病毒能有效地介導(dǎo)外源基因在肝干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，不影響其干細(xì)胞的生物學(xué)特性。肝干細(xì)胞可作為基因治療的載體攜帶目的基因，同時(shí)標(biāo)