肝細(xì)胞生成素基因治療大鼠肝纖維化的實驗研究.pdf

1、肝細(xì)胞生成素(hepatopoietin，HPO)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種肝臟增殖刺激因子，能刺激受損肝細(xì)胞的增殖。對HPO受體的研究發(fā)現(xiàn)，HPO受體僅分布在肝源細(xì)胞的表面，因此，HPO是一種肝臟特異性細(xì)胞因子。研究表明，HPO是一種非經(jīng)典的分泌蛋白質(zhì)，其分泌途徑不經(jīng)過高爾基體，由于其本身缺乏信號肽序列，其分泌效率不高，細(xì)胞表達(dá)的HPO主要在于細(xì)胞內(nèi)。這可能是與HPO同時具有細(xì)胞內(nèi)、外功能相適應(yīng)的一種機(jī)制。肝細(xì)胞生成素蛋白具有抑制肝纖維化的作

2、用，是一種安全、有效的治療肝纖維化藥物，但重組蛋白進(jìn)行肝纖維化治療存在廓清速度快，要反復(fù)給藥等缺點，采用基因治療的方法對肝纖維化進(jìn)行治療，將會克服上述不足。 在利用肝細(xì)胞生成素真核表達(dá)載體對肝纖維化進(jìn)行基因治療的研究中雖然取得了一定的治療效果，但結(jié)果并不理想，其原因可能在于他們的研究中一般是將肝細(xì)胞生成素基因直接克隆到非分泌性表達(dá)載體中，而由于肝細(xì)胞生成素本身無信號肽序列，所以，他們構(gòu)建的HPO表達(dá)載體雖然能夠在靶細(xì)胞中表達(dá)HP

3、O蛋白，但表達(dá)的HPO主要存在于細(xì)胞漿中，分泌到細(xì)胞外的量很少，導(dǎo)致血液中肝細(xì)胞生成素達(dá)不到有效的治療濃度，致使治療效果不理想。 要實現(xiàn)HPO基因?qū)Ω卫w維化良好的治療效果，必須解決HPO的高效分泌問題，如果不能實現(xiàn)HPO高效分泌表達(dá)，則分泌到血液中的HPO可能達(dá)不到理想的治療濃度。在本研究中我們采用外源性信號肽序列引導(dǎo)HPO在真核細(xì)胞中通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑進(jìn)行分泌，以實現(xiàn)HPO分泌的高效率，達(dá)到有效治療肝纖維化的目的。

4、 本研究中分為四個部分，包括有效引導(dǎo)HPO蛋白外源信號肽的確定、CCl<,4>誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的建立、HPO基因預(yù)防CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的實驗研究和HPO基因治療CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的實驗研究。 在第一部分中，我們選擇了IL-1受體拈抗劑(IL-1ra)的信號肽、一種高效人工信號肽序列和IgK鏈信號肽三種不同的信號肽序列，將它們分別融合表達(dá)在HPO的N末端，觀察它們引導(dǎo)HPO分泌的效率。將構(gòu)建的

5、含信號肽的HlPO表達(dá)載體及不含信號肽的HPO載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用Western-blot進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果表明，在選用的這三種信號肽中，來源于小鼠IgK鏈信號肽序列引導(dǎo)HPO分泌的效率最高。用Western blot方法直接檢測不經(jīng)濃縮的細(xì)胞上清，很容易就能檢測到分泌的HPO。而用不含信號肽的HPO真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中則檢測不到分泌的HPO。這充分說明無信號肽的HPO表達(dá)載體雖然能夠高效表達(dá)HPO，但其表達(dá)

6、的HPO分泌到細(xì)胞外的效率很低。 在第二部分中，我們對建立大鼠肝纖維化實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行了摸索。選用健康wistar。大鼠隨機(jī)分成五組，每組6只，分別用20％、30％、40％、50％四種用橄欖油稀釋的CCl<,4>濃度，按照2ml/kg體重劑量每周定時皮下注射，每周兩次，對照組同時注射等量的橄欖油。摸索建立肝纖維化模型所用的CCl<,4>濃度及誘導(dǎo)時問。連續(xù)注射4周、8周后分別處死大鼠，取肝組織用10％甲醛溶液固定后進(jìn)行蘇木素-伊紅(

7、HE)染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞損傷及膠原纖維增生程度。在CCl<,4>注射8周時，各組均有肝纖維化形成，但在40％CCl<,4>組和50％CCl<,4>組均有大鼠死亡，而20％CCl<,4>組大鼠的纖維化形成較輕微，因此確定選用30％作為肝纖維化模型的CCl<,4>濃度，誘導(dǎo)時間至少8周。 第三部分主要研究含外源信號肽的高分泌型HPO真核表達(dá)載體pSec-hhpo及不含信號肽的HPO真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-hpo對CCl<,4>誘

8、導(dǎo)肝纖維化大鼠的防治作用。將構(gòu)建的載體分別注射大鼠，隨后用CCl<,4>進(jìn)行誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，通過對血清中的轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)、Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢNP)、透明質(zhì)酸酶(HA)含量、肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量、肝組織中增殖細(xì)胞核抗原、α-平滑肌肌動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，以及肝組織切片的HE染色、飽和苦味酸-天狼星紅．偏振光鏡檢測肝組織中的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量等指標(biāo)，比較兩種質(zhì)粒對大鼠肝纖維化的防治作用。

9、 病理組織切片發(fā)現(xiàn)HPO治療組大鼠肝纖維化程度較模型組明顯減輕，顯示兩種HPO質(zhì)粒有明顯減輕大鼠肝纖維化形成的作用，分泌型HPO質(zhì)粒作用更加明顯，沒有明顯的纖維化形成；肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量的測定表明兩種HPO質(zhì)粒預(yù)防組大鼠肝組織膠原蛋白含量明顯低于模型組，HPO可顯著降低肝纖維化大鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平、血清HA、PⅢNP含量，天狼星紅染色顯示，模型組有明顯的Ⅰ型膠原分布，pcDNA-hpo治療組大鼠肝組織在中央靜脈及匯管區(qū)有極少量的膠

10、原纖維形成；pSec-hhpo治療組與正常對照組大鼠肝組織均未檢測到Ⅰ、Ⅲ型膠原的形成；免疫組化檢測結(jié)果顯示pSec-hhpo治療組大鼠肝臟增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞數(shù)最多，其次為pcDNA-hpo治療組，模型組大鼠肝臟增歹卣細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞較少，證明HPO質(zhì)粒能夠促進(jìn)受損肝細(xì)胞再生，以分泌型HPO質(zhì)粒作用最為明顯。同時，對α-平滑肌肌動蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β的蛋白表達(dá)情況的檢測結(jié)果也顯示模型組大鼠肝臟成有明顯的彌漫性分布，pSec-hhp

11、o治療組大鼠分布最較少，再次表明pSec-hhpo治療組大鼠的肝細(xì)胞狀態(tài)最好。通過對以上各項指標(biāo)的檢測，可以發(fā)現(xiàn)含信號肽的pSec-hhpo組各項指標(biāo)均低于模型組，同時肝組織切片的HE染色很直觀地顯示，pSec-hhpo組無明顯的纖維化。動物實驗的結(jié)果表明，兩種HPO真核表達(dá)質(zhì)粒對大鼠肝纖維化都具有一定防治作用，而分泌型HPO表達(dá)質(zhì)粒的療效更為明顯，幾乎能夠完全預(yù)防肝纖維化的形成。 第四部分主要是研究含外源信號肽高分泌型HPO真

12、核表達(dá)質(zhì)粒對CCl<,4>誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的治療作用。先用CCl<,4>進(jìn)行誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，在造模成功后，分別用pSec-hhpo、pcDNA-hpo兩種質(zhì)粒進(jìn)行治療。測定血清AST、ALT活性，透明質(zhì)酸酶(HA)、羥脯氨酸(Hyp)含量，同時蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡下觀察肝臟病變程度。 通過病理組織切片發(fā)現(xiàn)，HPO治療組大鼠肝組織損傷程度較模型組明顯減輕，兩種HPO表達(dá)質(zhì)粒均有保護(hù)大鼠肝臟的作用，分泌型HPO表達(dá)質(zhì)粒作用