川芎嗪對大鼠肝纖維化肝細(xì)胞癌基因干預(yù)作用及基因譜研究.pdf

1、目的： 本項研究利用基因芯片技術(shù)，對大鼠肝纖維化肝細(xì)胞的基因譜進(jìn)行分析，尋找肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞的差異基因，從基因水平探討肝纖維化的發(fā)病機制；同時觀察源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪對肝纖維化肝細(xì)胞癌基因的干預(yù)作用。 藥物： 川芎嗪生物發(fā)酵提取物晶體由上海愛普香料有限公司提供。將川芎嗪晶體3.5g溶于70ml的CCl<,4>與精制橄欖油(1∶6)混合液中(每ml含晶體0.05g)，60℃水浴并搖晃至溶解。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、 基因芯片： 大鼠12K全基因芯片購自上海生物芯片有限公司。 方法： 1．動物處理：健康SD雄性大鼠120只，體重180-220g，隨機分3組。模型組：參照并改進(jìn)Hernandez-Munoz法建立肝纖維化動物模型，腹腔注射0.2ml CCl4(精制橄欖油1∶6稀釋)，每周3次，共8周。正常組：以精制橄欖油按受試藥物組同等劑量和次數(shù)腹腔注射。藥物組：腹腔注射0.2ml川芎嗪CCl<,4>與精制橄欖油(1∶

3、6)混合液，(每ml含川芎嗪晶體0.05g)，每周3次，共8周。各組每隔2周分別處死2只動物用于肝細(xì)胞分離，6只動物用于血清制備，2只動物用于肝組織切片。 2．常規(guī)肝組織切片制備，部分用于常規(guī)H-E染色，部分用于免疫組織化學(xué)反應(yīng)。 3．血清的制備與檢測常規(guī)制備血清，自動生化分析儀檢測大鼠各組血清的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。 4．基因芯片制備 5．指標(biāo)檢測：采用血清學(xué)肝功指標(biāo)檢測各組大鼠肝

4、功能；采用免疫組織化學(xué)方法檢測模型組和藥物組大鼠肝組織p53和c-met的表達(dá)；采用基因芯片研究p53和c-met相關(guān)基因的表達(dá)；采用基因芯片研究CCl<,4>所致肝纖維化大鼠肝細(xì)胞基因譜的表達(dá)。 6．統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS軟件對相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，行單因素方差分析。 開展的相關(guān)實驗： 1．大鼠肝細(xì)胞基因芯片的制備 2．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪對肝纖維化模型動物的干預(yù)作用 3．源于生物

5、發(fā)酵提取物的川芎嗪對肝纖維化肝細(xì)胞相關(guān)癌基因表達(dá)的干預(yù)作用 4．CCl<,4>所致肝纖維化大鼠肝細(xì)胞基因譜研究 實驗結(jié)果： 1．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪可明顯減輕肝纖維化程度。 2．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪可改善肝臟功能，其藥物作用發(fā)揮于6-8周。 3．正常組和藥物組免疫組織化學(xué)反應(yīng)均無p53和c-met陽性反應(yīng)物檢出，8周模型組p53免疫組織化學(xué)反應(yīng)檢出陽性反應(yīng)物，主要分布于中央靜脈周圍。c

6、-met免疫組織陽性反應(yīng)物在6周和8周均有檢出。 4．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪可下調(diào)BG671424號編碼p53結(jié)合蛋白(LOC304798)的mRNA水平。 5．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪對HGF激活物基因在肝纖維化肝癌的早期具有上調(diào)作用，中晚期具有下調(diào)作用。 6．造模2周時，篩選出差異表達(dá)基因共184條，其中上調(diào)基因110條，下調(diào)基因74條；造模4周時，篩選出差異表達(dá)基因共273條，其中上調(diào)基因129條，下

7、調(diào)基因144條；造模6周時，篩選出差異表達(dá)基因361條，其中上調(diào)基因134條，下調(diào)基因227條；造模8周時，篩選出差異表達(dá)基因1872條，其中上調(diào)基因763條，下調(diào)基因1109條。 結(jié)論： 1．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪可明顯減輕肝臟損傷，保護(hù)肝臟功能，延緩肝纖維化進(jìn)程，其藥物作用發(fā)揮于6-8周。 2．源于生物發(fā)酵提取物的川芎嗪對肝纖維化后期的癌變有明顯抑制作用，可通過下調(diào)BG671424號編碼p53結(jié)合蛋白(L