中藥肝復(fù)康治療大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:該研究采用雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,皮下注射四氯化碳誘發(fā)肝纖維化模型,分別以中藥肝復(fù)康膠囊(高、中、低三種劑量)、秋水仙堿及肝脾康干預(yù).光鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞變性及炎性浸潤(rùn)情況;電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;偏振光顯微鏡觀察基質(zhì)膠原纖維沉積情況及膠原成分分析;血清檢測(cè)酶學(xué)及肝臟功能以評(píng)估肝復(fù)康療效.免疫組化檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β<,1>及層粘連蛋白(LN)的表達(dá);RT-PCR測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶(明膠酶-

2、A/MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)的基因表達(dá)來(lái)探討肝復(fù)康抗肝纖維化部分可能的機(jī)制.同時(shí)采用超聲組織定征技術(shù)對(duì)正常及不同程度纖維化大鼠肝臟的背向散射積分進(jìn)行測(cè)定,旨在探討超聲組織定征技術(shù)在肝纖維化中的應(yīng)用價(jià)值.方法:大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供雌性SD大鼠90只,體重100---150克,室溫20℃,自然晝夜,自由飲水?dāng)z食.利用四氯化碳皮下注射法(10﹪CCl<,4>,5ml/kg,每周兩次,共13周)制備肝纖維化模型,實(shí)

3、驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組:正常組、模型組、肝復(fù)康高劑量組、中劑量組、低劑量組、秋水仙堿組、肝脾康組.藥物治療從造模60天后開始,正常對(duì)照組與上述各組每日經(jīng)口分別灌服生理鹽水、生理鹽水、高劑量肝復(fù)康(3.125g/kg)、中劑量肝復(fù)康(0.3125g/kg)、低劑量肝復(fù)康(0.03125g/kg)、秋水仙堿(1mg/kg)、肝脾康(0.55g/kg),藥物的劑量根據(jù)體表面積的公式進(jìn)行換算,每千克體重用量為正常成人用量的6.25倍.按10ml/k

4、g體重灌服,治療時(shí)間為60天.在最后一次給藥24小時(shí)后,經(jīng)乙醚麻醉內(nèi)眥采血檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo),并取肝左葉作為檢測(cè)標(biāo)本.賴氏法測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性,采用溴甲酚綠比色法和考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定血清白蛋白、總蛋白及白球蛋白比,比色法測(cè)定血清羥脯氨酸(Hyp)及血清唾液酸(SA),消化法測(cè)定肝組織羥脯氨酸,免疫組化方法檢測(cè)肝組織LN、TGF-β<,1>表達(dá),光鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞變性及炎性浸潤(rùn)情況,電鏡觀察肝細(xì)胞超

5、微結(jié)構(gòu)改變,苦味酸-天狼猩紅染色在偏振光顯微鏡觀察基質(zhì)膠原纖維沉積情況及Image-Pro圖像分析系統(tǒng)分析Ⅰ、Ⅲ型膠原面積及其比值情況,RT-PCR測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)和金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)的基因表達(dá).采用HP5500型彩超儀,S<,4>超寬變頻相控陣探頭,探頭頻率2—4MHz進(jìn)行大鼠肝臟的背向散射積分定量分析.數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、單因素相關(guān)分析及成組設(shè)計(jì)秩和檢驗(yàn)(

6、等級(jí)資料),以p<0.05為顯著性檢驗(yàn)界限.結(jié)論:1.四氯化碳造模后大鼠呈現(xiàn)較重程度的肝纖維化,肝功能嚴(yán)重受損.同時(shí)其他檢測(cè)顯示肝組織TGF-β<,1>、LN及MMP-2和TIMP-1表達(dá)增強(qiáng).2.肝復(fù)康干預(yù)后,肝組織形態(tài)學(xué)、肝功能及血清指標(biāo)均說(shuō)明肝復(fù)康對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化有明確的治療作用,其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)西藥秋水仙堿和中藥肝脾康.中劑量組對(duì)肝纖維化的治療作用較為明顯,是較為合理的用藥劑量.3.肝復(fù)康抗肝纖維化機(jī)制可能為:保護(hù)肝細(xì)胞,減輕