中藥肝復康在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時的一個愈合修復過程，又是所有慢性肝病進展成肝硬化的共同病理基礎。有效的治療肝纖維化可以防止各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展。近年來，國內(nèi)外在對肝纖維化啟動和進展機制的研究方面取得了一定進展。但是在肝纖維化臨床治療領域，并沒有取得明顯的進步。許多西藥由于抗纖維化作用靶位單一，療效并不理想，而有些藥物毒副作用大于治療作用，不宜用于臨床。我國的中藥復方制劑具有多種藥效成分協(xié)同作用，安全性強的特點，具有顯著的優(yōu)勢。中藥肝復康

2、是本研究室多年來通過反復實驗總結出的抗纖維化經(jīng)驗方，即往的動物實驗已多次成功證實了肝復康對肝纖維化組織具有預防及治療作用。本實驗擬在肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)培養(yǎng)體系中加入血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及中藥血清，應用半定量RT-PCR技術，分別測定肝星狀細胞經(jīng)外源性PDGF處理，再通過不同濃度含藥血清干預后，其Ⅰ、Ⅲ型膠原及α-SMA

3、 mRNA的變化特點；并以Western blot檢測不同方式處理后肝星狀細胞STAT、ERK、P13-K蛋白的不同表達情況。從而進一步揭示中藥肝復康對肝星狀細胞在肝纖維化中的分子調(diào)節(jié)機制。 在肝纖維化發(fā)病的分子機理方面，盡管目前國內(nèi)外已從基因和轉錄水平進行了許多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，若能直接從蛋白質(zhì)整體水平入手來研究將更加全面、真實地揭示肝纖維化的演變過程。但迄今為止，有關中藥對肝星狀細胞的蛋白質(zhì)組

4、的干預實驗尚無報道。本實驗將首次開展中藥對肝星狀細胞和肝組織蛋白質(zhì)組的干預實驗，可望從蛋白質(zhì)組學角度進一步揭示肝纖維化的發(fā)病機制和中藥的藥理作用，為新藥研制提供理論依據(jù)。 方法 一、用RT．PCR方法檢測Ⅱ、Ⅲ型膠原及值α-SMA mRNA的變化將HSC分為5組：即空白對照組：加10﹪對照血清的DMEM；模型對照組：加10﹪對照血清+血小板衍生生長因子(終濃度60ng/ml)的DMEM：肝復康低劑量組：加10﹪低劑量藥物

5、血清+血小板衍生生長因子(終濃度60ng/ml)的DMEM；肝復康中劑量組：加10﹪中劑量藥物血清+血小板衍生生長因子(終濃度60ng/ml)的DMEM；肝復康高劑量組：加10﹪高劑量藥物血清+血小板衍生生長因子(終濃度60ng/ml)的DMEM，分別測定肝星狀細胞經(jīng)外源性PDGF處理，再通過不同濃度含藥血清干預后，其Ⅰ、Ⅲ型膠原及旺α-SMA mRNA的變化特點。 二、 Western b10t檢測不同方式處理后STAI、ER

6、K、P13-K蛋白的不同表達將HSC隨機分為6組，分別為：對照組：加10﹪正常對照血清的DMEM；模型組：加10﹪正常對照血清的DMEM；中藥組：加10﹪中劑量藥物血清；ERK阻斷劑組：加U0126(ERK阻斷劑，終濃度為10μmol/L)：P13K阻斷劑組：加LY-294002(P13K阻斷劑，終濃度為l0μmol/L)；STAT阻斷劑組：加Parthenolide(JAK-STAT阻斷劑，終濃度為50μ mol/L)。以上各組均作用

7、30分鐘后，除對照組外，其余各組均加入血小板衍生生長因子(終濃度60ng/ml)。反應10分鐘后，提取不同分組HSC總蛋白樣品，行Western blot檢測STAT、ERK、P13-K蛋白的不同表達。 三、二維電泳技術檢測肝組織及肝星狀細胞蛋白質(zhì)分子的動態(tài)表達肝星狀細胞2-D電泳：制備正常大鼠肝星狀細胞、加入血小板衍生生長因子的肝星狀細胞及加入肝復康藥物血清和血小板衍生生長因子的肝星狀細胞，分別設定為正常對照組、模型組及藥物組

8、。分別提取以上各組的總蛋白質(zhì)并進行等電聚焦電泳，隨后進行SDS-PAGE電泳。凝膠染色后比對蛋白質(zhì)斑點，找出上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。 肝臟組織2-D電泳：將對照組、模型組及藥物組大鼠肝臟取出，提取組織總蛋白質(zhì)，分別進行等電聚焦電泳，隨后進行SDS-PAGE電泳。凝膠染色后比對蛋白質(zhì)斑點，找出上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。 結果 一、藥物血清對肝星狀細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達的影響在空白對照組，HSCⅠ、Ⅲ型膠原mRN

9、A表達呈相對低水平；加入對照血清及PDGF刺激的模型對照組，HSC細胞顯示出對外源性PDGF刺激因子的敏感反應性，與空白對照組相比Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01)；在藥物血清觀測組，與模型對照組相比，由PDGF刺激誘導的HSCⅠ、Ⅲ型膠原mRNA表達增加明顯受到抑制(P<0.01)；不同藥物劑量產(chǎn)生的干預效果不同，肝復康各劑量之間比較，以中劑量組Ⅰ型膠原mRNA表達降低最明顯，優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，和高劑量組相比

10、無顯著性差異；中劑量組Ⅲ型膠原mRNA表達降低亦最明顯，但三個劑量組之間相比無顯著性差異。 二、藥物血清對肝星狀細胞α-SMA mRNA表達的影響在空白對照組，HSCα-sMA mRNA表達呈相對低水平；而模型對照組α-SMA mRNA表達呈明顯升高(P<0.01)；藥物血清各組則均具有能明顯抑制這種升高的作用(P<0.01)，其中以中劑量組干預效果最為明顯，但三個劑量組之間相比無顯著性差異。 三、肝星狀細胞STAT、E

11、RK、P13K蛋白的表達情況肝星狀細胞STAT、ERK、P13K蛋白表達在不同干預條件下存在差別，表現(xiàn)為對照組、模型組、中藥組、阻斷劑組各免疫印跡條帶的灰度及面積不同。中藥可有效抑制STAT、ERK、P13K蛋白的表達。此外，在分別應用STAT、ERK、P13K阻斷劑后，除相對應的蛋白質(zhì)表達明顯下調(diào)外，其余兩種蛋白質(zhì)的表達也有不同程度的下降。 四、 HSC蛋白質(zhì)的差異展示(一) 培養(yǎng)12小時后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培養(yǎng)12小時后

12、，分別提取對照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過處理后得出：對照組蛋白質(zhì)斑點數(shù)181個，模型組蛋白質(zhì)斑點數(shù)161個，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點數(shù)124個。 (二) 培養(yǎng)24小時后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培養(yǎng)24小時后，分別提取對照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過處理后得出：對照組蛋白質(zhì)斑點數(shù)189個，模型組蛋白質(zhì)斑點數(shù)229個，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點數(shù)397個。 (三) 培養(yǎng)48小時后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培

13、養(yǎng)48小時后，分別提取對照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過處理后得出：對照組蛋白質(zhì)斑點數(shù)118個，模型組蛋白質(zhì)斑點數(shù)183個，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點數(shù)81個。 (四) 不同治療時間蛋白質(zhì)的差異展示隨著治療時間的不斷延長，HSC的蛋白質(zhì)表達在不同時間有了不同變化．有的變化發(fā)生在治療后24小時，有的則發(fā)生在治療后的48小時。 五、肝組織蛋白質(zhì)的差異展示造模4周后，模型組與治療組肝組織總蛋白質(zhì)存在著一定差異。具體體現(xiàn)

14、為：蛋白質(zhì)斑點數(shù)不同，模型組217；治療組241。同時，部分蛋白質(zhì)在兩組中表現(xiàn)出不同的豐度。 結論 一、經(jīng)肝復康含藥血清處理，可下調(diào)HSC-T6細胞株Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA表達，不同濃度含藥血清作用強度也有所不同。其中以中劑量組干預效果最為明顯。中藥肝復康對肝纖維化具有明顯的抑制作用，其作用機制可能是通過非特異性干擾PDGF功能，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA的轉錄，以達到抗纖維化的作用。 二

15、、應用中藥肝復康可通過干預HSC主要信號轉導途徑，從而減弱STAT、ERK、P13-K的表達，以達到抗肝纖維化的目的。同時，在分別應用STAT、ERK、P13K阻斷劑后，除相對應的蛋白質(zhì)表達明顯下調(diào)外，其余兩種蛋白質(zhì)的表達也有不同程度的下降，因此，我們猜測在肝星狀細胞內(nèi)Ras/ERK、P13K和JAK/STAT途徑之間存在著相互作用，既cross-talk。 三、在對三個不同時間段的模型組肝星狀細胞蛋白質(zhì)的凝膠圖譜比較發(fā)現(xiàn)：每一