PKIP在大鼠肝纖維化發(fā)生機制中的作用研究.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝硬化乃至肝功能衰竭的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，是影響慢性肝病的重要環(huán)節(jié)，因此肝纖維化的預(yù)防、治療乃至逆轉(zhuǎn)是阻斷肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化也成為國內(nèi)外學(xué)者研究慢性肝病的焦點。我國是肝病高發(fā)國家，以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最為常見，在目前尚無良好的抗病毒藥物的情況下，阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程成為治療慢性肝病的重要對策。
　　 生理狀態(tài)下，HSCs在維生素A代謝和維持肝臟構(gòu)架（產(chǎn)生細(xì)胞外間質(zhì)

2、和通過收縮作用調(diào)節(jié)竇狀隙血流）中起重要作用。在慢性肝損傷過程中HSCs經(jīng)歷了表型轉(zhuǎn)化（激活），變成了高增殖活性的類維生素A缺乏細(xì)胞（表達(dá)α-SMA），激活的HSCs在肝纖維化，肝硬化，門脈高壓和肝癌形成過程中具有重要的作用。激活的HSCs獲得不斷增殖，合成大量的ECM分子，分泌細(xì)胞因子和生長因子，遷移和收縮的能力。肝星狀細(xì)胞在塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外培養(yǎng)時使HSCs的活化過程得到很好地重現(xiàn)。
　　 在肝纖維化和肝硬化過程中，Raf-

3、1/MEK/ERK1，2信號通路處于激活狀態(tài)。Raf-1/MEK/ERK1，2信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞生長，分化和遷移。許多不同的生長因子受體，包括PDGF和EGF受體通過小G蛋白Ras結(jié)合和聚集Raf-1激酶進(jìn)而激活ERK/MAPK信號通路。Raf-1磷酸化MEK接著磷酸化和激活ERK。磷酸化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核通過結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了致纖維化蛋白分子的表達(dá)。
　　 Yeung和他的同事們首次證明RKIP

4、通過直接與Raf-1上的激酶位點相互作用抑制ERK/MAPK信號通路。RKIP是廣泛表達(dá)的高度保守的胞漿蛋白，與其它的激酶抑制劑沒有同源性，是人們目前發(fā)現(xiàn)的唯一的Raf-1蛋白天然抑制劑。在非磷酸狀態(tài)下，RKIP通過與Raf-1結(jié)合阻止Raf-1磷酸化，干擾Raf/MEK結(jié)合，抑制MEK和下游分子的活化來達(dá)到負(fù)向調(diào)節(jié)Raf-1/MEK/ERK1，2信號通路的作用。磷酸化的RKIP從Raf-1上解離出來與GRK-2結(jié)合并阻斷其活性，GRK

5、-2是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的負(fù)反饋抑制蛋白。GRK-2使GPCRs磷酸化，從而將G蛋白與GPCRs解離導(dǎo)致G蛋白信號通路的活化。有數(shù)據(jù)表明RKIP被PKC磷酸化后能同時激活Raf-1/MEK/ERK1，2和GPCR信號通路。近些年來，RKIP被證明是一個抑制腫瘤細(xì)胞侵襲擴散的蛋白分子，包括前列腺癌，惡性黑色素瘤，乳腺癌，胰島細(xì)胞癌，直腸癌和肝癌。RKIP在MDCK表皮細(xì)胞中的作用則相反，RKIP過表達(dá)能使MDCK由表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為

6、成纖維樣細(xì)胞并且促進(jìn)細(xì)胞遷移。 Locostatin（是一種不具有抗菌作用的黃惡唑酮衍生物）能夠特異地消除RKIP對Raf-1的抑制作用，同時也是MDCK表皮細(xì)胞遷移抑制劑。進(jìn)一步的研究證明RKIP在正向調(diào)節(jié)細(xì)胞與基層黏附和負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞的黏附過程中具有重要作用。
　　 HSCs細(xì)胞形態(tài)改變和運動遷移構(gòu)成了一系列肝纖維化生物過程的重要部分。盡管RKIP在MDCK表皮細(xì)胞和高侵襲力腫瘤細(xì)胞中的作用已經(jīng)得到揭示，但是RKIP在肝

7、纖維化形成時HSCs中的作用卻知之甚少。在本實驗中，將揭示RKIP在肝纖維化組織的表達(dá)及其在HSCs細(xì)胞增殖和遷移中的作用。實驗內(nèi)容主要包括以下3部分：
　　 第一部分：肝纖維化大鼠肝組織中RKIP、p-RKIP、ERK和p-ERK的動態(tài)表達(dá)情況
　　 目的：研究RKIP在膽總管結(jié)扎肝纖維化大鼠肝臟組織的表達(dá)情況。
　　 方法：運用膽總管結(jié)扎方法制作大鼠肝纖維化模型，模型組分別于結(jié)扎后1周、2周、3周、4周麻醉動

8、物，假手術(shù)組與4周模型組同批麻醉，留取肝臟標(biāo)本。組織切片經(jīng)HE和Masson三色染色檢測病理變化，Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測RKIP在肝組織的表達(dá)，用Western blot方法檢測RKIP和ERK的磷酸化水平。
　　 結(jié)論：膽總管結(jié)扎大鼠肝纖維化形成過程中，肝臟組織磷酸化ERK表達(dá)明顯增加，存在Raf-1/MEK/ERK1，2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。RKIP表達(dá)水平下降，同時磷酸化RKIP水平升高，肝纖維化過程

9、中肝臟組織Raf-1/MEK/ERK1，2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活與RKIP的蛋白表達(dá)下降和磷酸化增加有關(guān)。
　　 第二部分：RKIP在大鼠原代肝星狀細(xì)胞活化中的作用
　　 目的：體外分離大鼠原代HSCs，研究RKIP在大鼠原代肝星狀細(xì)胞激活前后的表達(dá)情況。
　　 方法：應(yīng)用臺盼蘭染色，觀察細(xì)胞存活率。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察剛分離大鼠原代HSCs的自發(fā)熒光，以做特異性細(xì)胞鑒定。應(yīng)用單克隆抗體α-SMA做免疫細(xì)胞和Weste

10、rn blot以鑒定原代HSCs體外培養(yǎng)后的活化狀態(tài)。RT-real time PCR和Western blot方法檢測RKIP在原代HSCs的表達(dá)情況，用Western blot方法檢測RKIP、Raf-1和ERK1/2磷酸化水平。
　　 結(jié)論：采用原位灌注和密度梯度離心方法成功分離大鼠原代HSCS。原代HSCs體外培養(yǎng)活化之后信號通路Raf-1/MEK/ERK1，2處于激活狀態(tài)，而RKIP表達(dá)則明顯下降，p-RKIP表達(dá)則明

11、顯增加。
　　 第三部分：RKIP對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和遷移的影響
　　 目的：觀察RKIP對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。
　　 方法：大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6的培養(yǎng)采用含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液，重組質(zhì)粒pCMV5-HA-RKIP或者空載體用Lipofectamine2000包裹，按照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基；質(zhì)粒pCMV5-HA-RKIP轉(zhuǎn)染36 h后用50μMlocos

12、tatin或者0.1％ DMSO處理12 h，棄去培養(yǎng)基最后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白以用于Western blot分析。一抗封閉時采用抗RKIP、pRKIP、Raf-1、pRaf-1、ERK1/2、pERK1/2和β-actin蛋白抗體測定。RKIP過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HSC-T6采用MTT法測定HSCs增殖；采用TUNEL試劑盒測定HSCs凋亡率。 G418篩選RKIP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用Transwell小室對細(xì)胞進(jìn)行遷移評估；