細(xì)胞因子GP46、bFGF、MMP9在大鼠肝纖維化分子發(fā)生機(jī)制中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、近年來，有關(guān)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，業(yè)已證明肝星狀細(xì)胞(HepaticStellateCells，HSCs)的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，活化的HSCs向肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MFB)轉(zhuǎn)型，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)，沉積于肝組織，促進(jìn)肝纖維化的形成，整個(gè)過程有一系列的細(xì)胞因子參與調(diào)控。 46KD膠原結(jié)合糖蛋白(A46-kDaco

2、llagenbindingglycoprotein，GP46)、堿性成纖維細(xì)胞因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase9，MMP9)是研究證實(shí)能在大鼠肝臟表達(dá)或與組織纖維化有關(guān)的幾個(gè)細(xì)胞因子，在不同的動(dòng)物組織中觀察到這幾個(gè)因子之間似乎有內(nèi)在的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，但它們?cè)诟卫w維化形成過程中的具體作用、其間有無相互調(diào)節(jié)關(guān)系、它們和即刻早期基因ZF9是

3、否構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等均未見闡明。因此，深入研究這些問題對(duì)于進(jìn)一步明確肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理、篩選干預(yù)治療肝纖維化的理想靶點(diǎn)和理想模式有重要意義。 第一部分GP46、MMP9、bFGFmRNA和蛋白在正常及纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)與分布的動(dòng)態(tài)研究 目的：通過研究大鼠肝纖維化模型肝組織中GP46、bFGF、MMP9mRNA和蛋白水平的表達(dá)與分布規(guī)律，初步探討這三種蛋白在大鼠肝纖維化形成中的作用。 方法：皮下注射四

4、氯化碳和植物油混懸液誘導(dǎo)形成大鼠肝纖維化模型。通過免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR、Westernblot動(dòng)態(tài)檢測(cè)不同時(shí)相纖維化大鼠肝組織中GP46、bFGF、MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)和分布。同時(shí)通過V-G染色檢測(cè)肝組織纖維增生的程度和分布規(guī)律。 結(jié)果：隨著造模時(shí)間的延長，大鼠肝臟纖維逐漸增生，至8周末時(shí)已有明顯的纖維化和嚴(yán)重的肝細(xì)胞脂肪變性，增生的纖維在匯管區(qū)和中央靜脈及周圍組織出現(xiàn)得較早并且程度較重。GP46在大鼠纖維化肝

5、組織中的表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，主要分布在匯管區(qū)、中央靜脈附近和增生的纖維絲、纖維隔兩旁的組織以及血管壁中的間質(zhì)細(xì)胞和部分脂肪變嚴(yán)重的肝細(xì)胞胞漿中以及上述細(xì)胞分布區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)。bFGFmRNA和蛋白水平的表達(dá)增強(qiáng)趨勢(shì)類似于GP46，主要分布在纖維隔附近的區(qū)域、Disse間隙以及匯管區(qū)和中央靜脈附近的間質(zhì)細(xì)胞和部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞外亦可見片狀陽性區(qū)域，與陽性細(xì)胞分布規(guī)律大致相同。MMP9mRNA和蛋白表達(dá)較早即出現(xiàn)增強(qiáng)，至4周末時(shí)表達(dá)最

6、強(qiáng)，主要分布區(qū)域亦在匯管區(qū)和中央靜脈周圍組織，8周末時(shí)，表達(dá)下降，區(qū)域彌散。 結(jié)論：GP46的表達(dá)強(qiáng)度與四氯化碳所致的大鼠肝臟纖維組織增生在時(shí)間和空間上有著明顯的一致性，可能與大鼠肝纖維化密切相關(guān)。bFGF亦與四氯化碳所致的大鼠肝纖維化密切相關(guān)，它可能是肝纖維化的一種刺激因子。HSCs亦可能是bFGF的重要來源，bFGF可能是通過自分泌刺激和旁分泌刺激兩種途徑參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝的。MMP9在肝纖維化進(jìn)展過程中可能阻止肝纖維化進(jìn)展

7、。 第二部分GP46、MMP9、bFGFmRNA和蛋白在正常及纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞中表達(dá)與分布的動(dòng)態(tài)研究 目的：通過研究大鼠肝纖維化模型肝組織分離培養(yǎng)的HSCs中GP46、bFGF、MMP9mRNA和蛋白水平的表達(dá)與分布規(guī)律，以進(jìn)一步從細(xì)胞層面探討這三種蛋白參與肝纖維化形成的機(jī)理。 方法：四氯化碳肝纖維化模型的構(gòu)建同第一部分。每一組造模結(jié)束時(shí)通過膠原酶離體灌流消化法分離培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，RT-PCR和western

8、blot檢測(cè)HSCs中GP46、bFGF、MMP9基因mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：隨造模時(shí)間的延長，分離的HSCs表型逐漸向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。HSCs中的GP46、bFGF和COLα2(I)mRNA和蛋白水平的表達(dá)均有逐漸遞增的趨勢(shì)。MMP9的表達(dá)則上升得更快，且4周時(shí)即達(dá)到高峰，8周時(shí)又有所回落。 結(jié)論：隨著造模時(shí)間的延長，HSCs逐漸活化，表型和數(shù)量均有改變。GP46在肝纖維化過程中的作用可能是通過HSCs達(dá)到的，

9、即GP46促進(jìn)HSCs的活化，活化的HSCs又提高了GP46的生成，形成正反饋?zhàn)饔?。HSCs能產(chǎn)生bFGF得到進(jìn)一步證實(shí)，GP46和bFGF蛋白在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮促進(jìn)作用的機(jī)理可能是通過自分泌和旁分泌兩種途徑參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝。 第三部分大鼠肝纖維化形成中ZF9、GP46、bFGF以及ZF9、GP46、MMP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究 目的：進(jìn)一步闡明GP46、bFGF、MMP9在肝星狀細(xì)胞活化中的調(diào)節(jié)關(guān)系，了解ZF9、GP

10、46、bFGF以及ZF9、GP46、MMP9是否構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并在肝星狀細(xì)胞活化中起調(diào)節(jié)作用。 方法：在培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞株HSC-T6中轉(zhuǎn)染ZF9表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-ZF9以促進(jìn)HSC-T6的活化，再分組共轉(zhuǎn)染GP46正義寡核苷酸和GP46反義寡核苷酸。RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中的ZF9和GP46的mRNA表達(dá)，Westernblot檢測(cè)HSC-T6中的GP46、bFGF、MMP9、COLα2(I)蛋白的表達(dá)。

11、結(jié)果：轉(zhuǎn)染pcDNA3-ZF9顯著提高了ZF9、GP46和COLα2(I)的表達(dá)，并進(jìn)一步提高bFGF和MMP9的表達(dá)，共轉(zhuǎn)染GP46反義寡核苷酸后GP46、bFGF、COLα2(I)下降至微弱表達(dá)，MMP9表達(dá)有下降但仍有一定量的表達(dá)。 結(jié)論：pcDNA3-ZF9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能使“靜止?fàn)顟B(tài)”的HSC-T6表達(dá)ZF9，后者刺激GP46表達(dá)升高，又進(jìn)一步刺激了bFGF和MMP9的表達(dá)，最終使COLα2(I)表達(dá)上調(diào)，阻滯了GP46的表

12、達(dá)就阻斷了這一信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞，ZF9、GP46、bFGF和ZF9、GP46、MMP9在大鼠肝纖維化過程中構(gòu)成了兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)膠原代謝起著不同的調(diào)節(jié)作用，其中GP46是一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子。阻斷GP46對(duì)肝纖維化有抑制作用，但作用并不完全。以GP46為靶標(biāo)干預(yù)肝纖維化可能要結(jié)合干預(yù)GP46下游的其他細(xì)胞因子方可助良效。 第四部分中藥復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)大鼠肝纖維化的作用 目的：探討抗纖維化中藥復(fù)方鱉甲軟肝片抗肝纖維化的作用及其

13、與GP46基因的關(guān)系方法：四氯化碳/植物油混懸液(1：1，v/v)四肢內(nèi)側(cè)皮下注射制作大鼠肝纖維化模型，干預(yù)組用生理鹽水配制的鱉甲軟肝片灌胃，1粒/(只·次)，每天一次，連續(xù)8周。觀察肝組織的病理變化、血清肝酶譜(ALT、AST、AKP、γ-GT)的變化，放免法檢測(cè)PⅢP、Ⅳ型膠原、HA、LN的水平，RT-PCR檢測(cè)第八周造模組和干預(yù)組肝組織GP46mRNA水平。 結(jié)果：復(fù)方鱉甲軟肝片能明顯減輕大鼠纖維化肝組織的病理改變，降低血