PDGF信號通路在胰纖維化分子發(fā)生機(jī)制中作用的實驗研究.pdf

1、慢性胰腺炎在病理組織學(xué)上以胰腺纖維化為主要特征。建立有效的體內(nèi)、外胰纖維化模型，對于研究胰纖維化的發(fā)病機(jī)制、探索新的診斷和治療方法都有著重要意義。胰星狀細(xì)胞(pancreaticstellatecell，PSC)與肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)在形態(tài)學(xué)和富含VitA脂滴等特征上極為類似，因而推測PSC在胰纖維化中可能具有重要作用。PSC的活化是PSC產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix

2、，ECM)的關(guān)鍵，深入研究PSC活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在不同靶點進(jìn)行激活、阻止或抑制其活化的研究，對于闡明以及找到減輕甚至逆轉(zhuǎn)纖維化形成的有效方法將具有決定性意義。細(xì)胞因子TGF-β、PDGF等可以活化PSC，導(dǎo)致PSC快速增殖和大量分泌ECM。文獻(xiàn)報道，PDGF在胰纖維化發(fā)生中可能起著關(guān)鍵的絲裂原作用，但該通路誘導(dǎo)PSC活化的分子機(jī)制、對ECM的調(diào)節(jié)作用以及信號通路的限速環(huán)節(jié)尚不十分清楚。本研究著重探討細(xì)胞因子PDGF信號通路及中間信號

3、分子ERK1在大鼠PSC活化和ECM產(chǎn)生中體內(nèi)和體外的生物學(xué)效應(yīng)。 第一部分蛙皮縮膽囊肽誘致大鼠胰纖維化的實驗研究 目的：采用CCK類似物蛙皮縮膽囊肽反復(fù)誘致大鼠胰腺炎，旨在有效建立大鼠胰纖維化模型，以進(jìn)一步探討胰纖維化發(fā)生的分子機(jī)制。 方法：SD大鼠蛙皮縮膽囊肽50μg/kg腹腔注射，每周3次，分別于第2周、第4周和第8周處死大鼠，采用HE染色和VG膠原染色觀察不同時期胰腺病理組織學(xué)變化和結(jié)締組織增生情況。同時

4、，采用RT-PCR法檢測不同造模時期胰腺中Colα1(Ⅰ)mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：造模第2周和第4周，胰腺間質(zhì)中可見明顯的炎性細(xì)胞侵潤；第8周，“管狀復(fù)合體”形成，間質(zhì)纖維結(jié)締組織大量增生并向小葉內(nèi)伸展，膠原纖維交織成網(wǎng)狀；而且隨著造模時間的延長，Colα1(Ⅰ)基因的表達(dá)逐漸上調(diào)。 結(jié)論：蛙皮縮膽囊肽多次大劑量腹腔注射致反復(fù)急性胰腺炎發(fā)作可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰纖維化，Colα1(Ⅰ)mRNA水平隨造模時間延長逐漸升高，

5、其機(jī)制可能與細(xì)胞信號分子介導(dǎo)的胰星狀細(xì)胞活化而發(fā)生表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。 第二部分細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1基因在胰纖維化大鼠胰腺中的表達(dá) 目的：探討細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1(extracelluarsignalregulatedkinase-1，ERK1)介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路在蛙皮縮膽囊肽誘致的大鼠胰纖維化發(fā)生機(jī)制中的可能作用。 方法：SD大鼠腹腔內(nèi)每周三次反復(fù)注射50μg/kg蛙皮縮膽囊肽，建立大鼠胰纖維化模型；采用免疫組織

6、化學(xué)染色法檢測胰纖維化大鼠胰腺中ERK1蛋白的表達(dá)及分布情況，RT-PCR半定量測定不同造模時期ERK1mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：蛙皮縮膽囊肽造模第2周時，可見急性水腫型胰腺炎表現(xiàn)，大量炎性細(xì)胞侵潤尤其是中性粒細(xì)胞侵潤。第8周HE染色見顯著胰纖維化征象。與纖維化進(jìn)程相平行，胰腺組織中ERK1蛋白和ERK1mRNA亦逐漸升高。 結(jié)論：實驗表明，ERK1介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路在胰纖維化分子發(fā)生機(jī)制中可能具有重要作用。 第

7、三部分大鼠胰星狀細(xì)胞的體外分離培養(yǎng) 目的：探索一種體外分離培養(yǎng)胰星狀細(xì)胞(PSC)的新方法，為進(jìn)一步研究胰纖維化的分子發(fā)生機(jī)制打下實驗基礎(chǔ)； 方法：采用改良胰蛋白酶消化法體外分離培養(yǎng)PSC，同時采用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色和熒光倒置顯微鏡觀察對原代培養(yǎng)的PSC加以鑒定； 結(jié)果：PSC具有HSC相似的特征，細(xì)胞呈梭形或星形，細(xì)胞骨架蛋白GFAP染色陽性，由于胞質(zhì)內(nèi)含VitA脂滴，在熒光倒置顯微鏡下

8、于328nm波長處可見自發(fā)綠色熒光； 結(jié)論：酶消化法體外分離培養(yǎng)PSC，方法簡單、經(jīng)濟(jì)、易行，重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究PSC的活化與抑制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制提供了有用的體外模型。 第四部分血小板生長因子活化胰星狀細(xì)胞的分子機(jī)制研究 目的：血小板生長因子(PDGF)是誘導(dǎo)胰星狀細(xì)胞(PSC)活化的重要細(xì)胞因子，其分子機(jī)制尚不清楚。采用PDGF-BB誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的PSC，旨在探討PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胰纖維化形成的

9、分子發(fā)生機(jī)制中的可能作用。 方法：PSC與不同劑量PDGF-BB(10ng/mL，25ng/mL和50ng/mL)共同培養(yǎng)，24h后收集細(xì)胞，采用Western-blotting檢測PSC中磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1(pERK1)蛋白水平和RT-PCR檢測Colα1(Ⅰ)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：不同劑量PDGF-BB作用于PSC后，各組pERK1蛋白表達(dá)比空白對照組有不同程度上調(diào)；Colα1(Ⅰ)mRNA在PSC中表達(dá)

10、也明顯上調(diào)，且在一定范圍內(nèi)與PDGF-BB劑量呈正相關(guān)。 結(jié)論：PDGF-BB激活PSC的作用可能是通過Ras-MAPK途徑上游信號分子激活ERK1而形成活性的磷酸化ERK1即pERK1來實現(xiàn)，同時該途徑與細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原的產(chǎn)生有密切關(guān)系。 第五部分PD98059對血小板生長因子介導(dǎo)的大鼠胰星狀細(xì)胞活化的影響 目的：與肝星狀細(xì)胞(HSC)相類似，胰星狀細(xì)胞(PSC)可能是胰纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化與

11、抑制過程是胰纖維化發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵所在。本研究采用PDGF-BB及ERK特異性抑制劑PD98059分別作用于體外培養(yǎng)的PSC，以探討PDGF信號通路在PSC活化與抑制過程中的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：體外培養(yǎng)的PSC與25ng/mL的PDGF-BB和不同劑量的PD98059(5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL和40ng/mL)共培養(yǎng)，37℃，24h后收集細(xì)胞，采用Western-blotting檢測各組PSC中磷酸化細(xì)胞外信號

12、調(diào)節(jié)激酶-1(pERK1)蛋白水平和RT-PCR檢測Colα1(Ⅰ)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：各組間pERK1蛋白表達(dá)水平有明顯差異，其中PDGF-BB處理組pERK1蛋白表達(dá)顯著升高，PD98059處理后各組pERK1蛋白表達(dá)明顯下降，pERK1蛋白表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)與PD98059劑量呈負(fù)相關(guān)，其抑制作用以20ng/mL為最佳(P＜0.01)；PDGF-BB處理組Colα1(Ⅰ)mRNA表達(dá)最高，PD98059處理后各組Co