脂聯(lián)素抑制小鼠心肌纖維化分子機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　心肌纖維化是高血壓、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病的共同結(jié)果，同時(shí)也是多種心血管疾病如心功能不全、心律失常等的病因。研究表明，心肌纖維化是可逆轉(zhuǎn)的病理過程，但是尚缺乏明確的干預(yù)措施。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性激素,具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)保護(hù)作用。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，血漿脂聯(lián)素水平與心肌纖維化程度有明確的相關(guān)性，并且經(jīng)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，脂聯(lián)素

2、具有抑制心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。本研究在此基礎(chǔ)上初步探討脂聯(lián)素抑制心肌纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　目的：
　　1、分離培養(yǎng)原代乳小鼠心臟成纖維細(xì)胞（MCFs）并鑒定。
　　2、觀察APN對(duì)血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖及纖維化相關(guān)信號(hào)分子的影響，從而探尋APN抗纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法
　　1、細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定：
　　取日齡1-3d的C57乳鼠心室肌組織，采用冷胰酶消化

3、法分離細(xì)胞，貼壁差速法獲得純化的小鼠心臟成纖維細(xì)胞，形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)（IF）技術(shù)進(jìn)行鑒定。
　　2、分組及檢測(cè)：
　?。?）將培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為五組，分別為對(duì)照組、AngⅡ處理組、APN1μg/ml+Ang II組、APN5μg/ml+Ang Ⅱ組、APN25μg/ml+Ang Ⅱ組。各組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24小時(shí)，不同濃度APN預(yù)處理1h后，加入Ang Ⅱ作用24小時(shí)。MTT比色法檢測(cè)APN對(duì)An

4、gⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響；蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)APN對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞p-ERK/ERK、TGF-β1、NF-κB、GSK-3β/p-GSK-3β、β-catenin等蛋白表達(dá)及活化的影響。（2）將心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為3組，別為對(duì)照組、Ang Ⅱ組、APN組，免疫細(xì)胞化學(xué)（IF）檢測(cè)脂聯(lián)素對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)位的影響。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表

5、示，各組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以 P﹤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1、小鼠心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　采用冷胰酶聯(lián)合膠原酶消化法分離培養(yǎng)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞獲得率高，經(jīng)免疫熒光結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，細(xì)胞純度接近100％。
　　2、脂聯(lián)素對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖及MAPK/ERK,TGF-β1,NF-κB，Wnt信號(hào)通路影響的測(cè)定

6、>　　2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組細(xì)胞增殖明顯（P＜0.01）；與Ang Ⅱ相比脂聯(lián)素各濃度組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脂聯(lián)素各濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 IF結(jié)果顯示：
　　熒光標(biāo)記的p65在Ang Ⅱ組核內(nèi)濃集最高，脂聯(lián)素組其次，對(duì)照組最弱。說明脂聯(lián)素可能通過部分抑制Ang Ⅱ的誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制心肌纖維化。
　　2.3 W

7、estern結(jié)果顯示：
　　①脂聯(lián)素各濃度組TGF-β1表達(dá)量與Ang Ⅱ組相比均顯著降低（AngⅡ組 vs對(duì)照組P＜0.01，脂聯(lián)素組vs Ang Ⅱ組P＜0.01），表明脂聯(lián)素能夠逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)的增加。②ERK1/2在對(duì)照組、Ang Ⅱ組及脂聯(lián)素各濃度組表達(dá)均無差異（P＞0.05）；Ang Ⅱ組p-ERK、p-ERK/t-ERK與對(duì)照組相比均明顯升高（P＜0.01）；脂聯(lián)素25μg/ml組p-ERK、p-

8、ERK/t-ERK與Ang Ⅱ組相比明顯降低（P＜0.05），脂聯(lián)素1μg/ml、5μg/ml組均未見到陽性結(jié)果（P＞0.05），說明高劑量的脂聯(lián)素能夠抑制ERK1/2的磷酸化，從而發(fā)揮抗纖維化作用。③Ang Ⅱ能夠顯著抑制CFs GSK-3β的表達(dá)并增加其磷酸化狀態(tài)（P均＜0.01），而脂聯(lián)素能夠顯著逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，表現(xiàn)為脂聯(lián)素5、25μg/ml組與Ang Ⅱ組相比GSK-3β表達(dá)升高（P＜0.01）；p-GSK3β/t-GSK3β脂聯(lián)素

9、各組與Ang Ⅱ組相比均明顯降低（P＜0.01），且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明脂聯(lián)素對(duì)GSK-3β活性的影響呈現(xiàn)劑量依賴性。對(duì)其下游信號(hào)分子β-Catenin的檢測(cè)也得到了一致的結(jié)果：脂聯(lián)素5、25μg/ml能夠顯著降低β-Catenin在胞漿中的表達(dá)(與Ang Ⅱ組相比，P均＜0.01)，且兩濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即脂聯(lián)素對(duì)β-Catenin的影響也呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　結(jié)論：