抑制TRPC3-6表達(dá)減輕糖尿病心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　2011年中國因糖尿病(diabetes mellitus，DM)死亡的人數(shù)多達(dá)113萬，其中繼發(fā)于糖尿病的心臟并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因（超過70％）。其中糖尿病心肌病(Diabetes cardiomyopathy,DCM)發(fā)病率高，預(yù)后差，極大影響生活質(zhì)量。與非糖尿病性心臟病相比糖尿病心肌病發(fā)病早，但癥狀通常較為隱蔽，多表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，且梗死面積相對較大，易穿壁，其與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率

2、和高病死率密切相關(guān)。該病患者多數(shù)處于亞臨床期，在此期間主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大和心肌纖維化，之后隨病情進(jìn)展逐漸發(fā)生心臟收縮功能異常。糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前具體機(jī)制尚未被完全闡明。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel，TRPC)過表達(dá)在糖尿病神經(jīng)病變中神經(jīng)元凋亡，糖尿病腎病中足細(xì)胞功能損傷和肺動脈高壓等過程中發(fā)揮了重要作用，而抑制TRPC的表達(dá)對于延緩神經(jīng)

3、元凋亡、修復(fù)足細(xì)胞功能、緩解肺動脈高壓有著較為確切的效果。本實(shí)驗(yàn)通過TRPC3/6通道阻滯劑SKF96365下調(diào)TRPC3/6在心肌細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測心肌纖維化的相關(guān)指標(biāo)，探討TRPC阻滯劑對于糖尿病心肌纖維化的改善作用。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分組:SPF級雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為A組（空白對照組）、B組（糖尿病對照組）和C組（糖尿病+TRPC阻滯劑干預(yù)組），其中B組、C組為Ⅱ型糖尿病大鼠。
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4、病大鼠模型制備方法如下:4周齡大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后、A組予正常飲食，B組、C組予高糖高脂飲食（脂肪熱量百分比60％，碳水化合物（蔗糖）熱量百分比22％，蛋白質(zhì)熱量百分比18％，總熱量約為5.5千卡/克）8周。禁食24小時后B組、C組腹腔注射1％鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)35mg/Kg，A組注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。24小時及48小時后檢測指標(biāo)，以空腹血糖＞11.1mmol/L,餐后血糖＞16.7mmol/L,糖化

5、血紅蛋白＞6％，尿糖定性（+++）以上，且出現(xiàn)多飲多食現(xiàn)象為造模成功者。若不成功，首次腹腔注射72小時后再次禁食24小時，腹腔注射STZ17.5mg/kg，24小時后復(fù)查各項(xiàng)指標(biāo)，成模標(biāo)準(zhǔn)同上。
　　實(shí)驗(yàn)流程:之后C組予0.74μmol/kgSKF96365每日一次腹腔注射。A組、B組予等量生理鹽水腹腔注射。期間A組普通飲食，B組、C組繼續(xù)高糖高脂飲食，監(jiān)測體重、血糖。12周后處死取材，測定全心重、左心室重量，計(jì)算心臟比例，左心室

6、比例;HE染色觀察心肌纖維、核的分布、排列等;Masson染色觀察并鑒別膠原纖維和肌纖維，計(jì)算心肌組織膠原纖維容積分?jǐn)?shù)(CVF);RT-PCR法擴(kuò)增TRPC3mRNA、TRPC6mRNA產(chǎn)物后通過瓊脂糖凝膠電泳法測定其含量。
　　數(shù)據(jù)處理:全部結(jié)果以SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首選單因素方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則采用最小顯著性差異法（LSD法），若方差不齊

7、則采用秩和檢驗(yàn)或person相關(guān)分析。若p＜0.05則說明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　相比于A組，B組、C組大鼠體重下降，血糖上升，全心重，左室重上升，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但B組、C組之間體重?zé)o明顯差異(p＞0.05);HE染色見B、C組心肌細(xì)胞排列欠規(guī)則，嚴(yán)重者可見局灶性壞死、C組相對B組程度較輕;Masson染色見B組、C組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)升高，其中B＞C(p＜0.05);RT-P

8、CR及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果提示B組、C組TRPC3mRNA和TRPC6mRNA相對A組表達(dá)上調(diào)，且B＞C(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制可能與TRPC3和TRPC6的過表達(dá)有關(guān):TRPC3、TRPC6過表達(dá)可上調(diào)心肌細(xì)胞膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、肌動蛋白等的表達(dá)，使其沉積增多，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和纖維化，進(jìn)而引起DCM的發(fā)生。抑制TRPC3、TRPC6表達(dá)可減輕心肌纖維化病變程度。通過該項(xiàng)研究探究了TRP