糖基化終產(chǎn)物在糖尿病心肌纖維化中的意義及羅格列酮干預(yù)作用.pdf

1、本研究分為三部分： 第一章：糖基化終產(chǎn)物對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成的影響及羅格列酮干預(yù)作用 目的：探討糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖、膠原合成、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和Smad2、Smad4蛋白表達(dá)的影響及羅格列酮的干預(yù)作用。 方法：采用胰酶消化法和差速貼壁分離法獲取CFs,應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀(FCM)法分別觀察不同時(shí)間、濃度AGEs及羅格列酮對(duì)CFs的細(xì)胞增殖、細(xì)

2、胞周期的影響,ELISA法測(cè)定CFs培養(yǎng)上清中膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的含量,Western印跡技術(shù)檢測(cè)CTGF及Smad2、Smad4蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果:AGEs(0-200 mg/L)干預(yù)CFs,隨濃度、時(shí)間的增加,細(xì)胞增殖更加顯著,最大效應(yīng)值為200 mg/LAGEs,而400 mg/LAGEs組MTT法490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值(A值)與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05),羅格列酮(0.1,1,10 μmol/L)干預(yù)后,A值

3、與S期細(xì)胞百分值明顯降低,而G0/G1期的細(xì)胞百分值明顯增高,與AGEs(200 mg/L)組相比P<0.01,并且隨濃度的增加,抑制細(xì)胞增殖的作用更加顯著。AGEs(200 mg/L)組CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白含量分別為(85.54±2.28和40.75±2.70 ng/mL),與對(duì)照組(19.79±2.60和12.79±3.61 ng/mL)相比明顯增高(P<0.01),給予羅格列酮(0.1,1,10 μmol/L)干預(yù)后,

4、隨著濃度的增高,CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量呈遞減趨勢(shì),較AGEs組明顯降低(P<0.01)。AGEs(0-400 mg/L)與CFs共同9呼育,隨時(shí)間和濃度的增加,CTGF蛋白表達(dá)增加,羅格列酮(0.1,1,10 μmol/L)與AGEs共同干預(yù)CFs,可部分抑制CTGF蛋白表達(dá)的增加(P<0.01),并隨濃度的增加,抑制作用更加顯著,并且細(xì)胞CTGF的蛋白表達(dá)水平與培養(yǎng)上清中I型膠原蛋白含量呈顯著正相關(guān)(r=0.9

5、44,P<0.01)。以空白組為對(duì)照,AGEs(200 mg/L)組Smad2、Smad4蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01),羅格列酮(1,10μmol/L)干預(yù)后可顯著減少AGEs誘導(dǎo)的Smad2、Smad4的蛋白表達(dá),并隨濃度的增加,抑制作用更加顯著(分別P<0.05,P<0.01)。 第二章：糖基化終產(chǎn)物對(duì)心肌成纖維細(xì)胞分泌NO、TGF-β1和氧化失衡影響及羅格列酮干預(yù)作用 目的：探討糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)培養(yǎng)乳

6、鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFs)分泌一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和氧化失衡的影響及羅格列酮的干預(yù)作用,同時(shí)初步了解NF-κB途徑在AGEs調(diào)控CFs增殖和膠原合成中的作用。 方法：應(yīng)用硝酸還原酶法分別測(cè)定不同時(shí)間、濃度AGEs及羅格列酮作用下CFs培養(yǎng)上清中的NO水平,ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1水平,分光光度法檢測(cè)不同條件下CFs上清液SOD、MDA含量,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察NF-κB活化并轉(zhuǎn)位

7、入細(xì)胞核的過程。 結(jié)果:AGEs(50-400 mg/L)增加CFs培養(yǎng)上清的MDA含量,降低SOD的活性(P<0.01),并隨濃度、時(shí)間的增加,作用更加顯著,AGEs(50-400)mg/L抑制CFs分泌NO、刺激CFs分泌TGF-β1(P<0.01),并隨濃度、時(shí)間的增加,作用更加顯著,羅格列酮(0.1,1,10 μmol/L)可以抑制AGEs引起的上述作用,并隨濃度的增加,抑制作用更加顯著。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,CFs細(xì)胞漿內(nèi)NF

8、-κB表達(dá)為陽(yáng)性,但細(xì)胞核表達(dá)為陰性,在AGEs(200 mg/L)作用下,NF-κB在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),且主要定位于細(xì)胞核內(nèi),在羅格列酮(10μmol/L)和AGEs(200 mg/L)共同作用下,細(xì)胞核及細(xì)胞漿中NF-κB仍為陽(yáng)性表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度較AGEs組降低,羅格列酮(10 μmol/L)單獨(dú)作用,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)為陰性,細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)為陽(yáng)性。 第三章：糖基化終產(chǎn)物在糖尿病大鼠心肌纖維化中的意義及羅格列

9、酮干預(yù)作用 目的：探討糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病大鼠心肌纖維化中的意義,以及羅格列酮對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清糖基化終產(chǎn)物(AGEs)水平、心肌纖維化及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 方法：鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(CON,n=8)、糖尿病組(DM,n=11)、羅格列酮治療組(RGZ,n=11),用藥12周。測(cè)血糖、體重、糖化血紅蛋白、心臟重量,用熒光法測(cè)定大鼠血清AGEs水平,透射電

10、鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),利用Masson染色檢測(cè)左室心肌膠原含量,氯氨T法測(cè)定心肌羥脯氨酸含量,代表心肌膠原總含量,ELISA法檢測(cè)血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)水平,應(yīng)用心肌免疫組織化學(xué)染色測(cè)定心肌NF-κB、膠原蛋白I和III的蛋白表達(dá),Western印跡技術(shù)檢測(cè)心肌CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：與CON組相比,DM組大鼠血清AGEs水平明顯上升(3.29±0.34 vs 5.95±0.3

11、6,P<0.01),左室心肌組織膠原含量明顯升高(10％±3％ vs 16％±2％,P<0.01),存在心肌間質(zhì)纖維化,糖尿病組血清中MCP-1、TNF-α水平明顯升高分別為(17.5±2.8 vs 34.2±3.9,P<0.01;5.0±1.4 vs 9.8±2.5,P<0.01)、心肌NF-κB、膠原蛋白I、III及CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高。與DM組相比,RGZ組血清AGEs水平明顯降低(5.95±0.36 vs 4.71±0

12、.31,P<0.01),但仍高于CON組,左室心肌組織膠原含量明顯下降(16％±2％vs 12％±3％,P<0.05),血清中MCP-1、TNF-α水平明顯減少(34.2±3.9 vs 20.2±3.2,P<0.01;9.8±2.5 vs 6.5±2.1,P<0.01),并且各組大鼠血清AGEs水平與TNF-α、MCP-1含量,均呈顯著正相關(guān)(P<0.01.);與DM組相比,RGZ組大鼠心肌NF-κB、膠原蛋白I、III及CTGF蛋白質(zhì)

13、表達(dá)水平明顯降低。 結(jié)論： 1、AGEs刺激CFs增殖及膠原合成,同時(shí)誘導(dǎo)CFs的CTGF、Smad2及Smad4蛋白表達(dá),羅格列酮在一定程度上抑制AGEs上述作用,并且CTGF蛋白表達(dá)與培養(yǎng)上清中I型膠原蛋白含量呈顯著正相關(guān),表明羅格列酮抑制CFs增殖和膠原合成的效應(yīng)與CTGF/Smad通路密切相關(guān)。 2、AGEs刺激CFs增殖,抑制CFs分泌NO、刺激CFs分泌TGF-β1及誘導(dǎo)氧化失衡,羅格列酮能明顯抑制A

14、GEs誘導(dǎo)的CFs增殖,可能與羅格列酮抗氧化及抑制AGEs誘導(dǎo)的CFs分泌NO減少,及CFs分泌TGF-β增加有關(guān)。 3、糖尿病大鼠血清AGEs水平增高,心肌膠原含量增加,同時(shí)心肌膠原蛋白I、III和CTGF表達(dá)增加,大鼠血清AGEs水平與TNF-α、MCP-1含量,呈顯著正相關(guān),羅格列酮能明顯抑制糖尿病大鼠心肌纖維化,并能顯著降低糖尿病大鼠血清AGEs、MCP-1、TNF-α水平及心肌NF-κB、CTGF、膠原蛋白I、III的