糖基化終產(chǎn)物在糖尿病血管鈣化中的作用及羅格列酮干預效應(yīng)的研究.pdf

1、背景和目的：以鈣鹽沉積及相關(guān)變化為特點而發(fā)生在骨骼的骨化、鈣化是人體內(nèi)常見的生理性過程。但異位的鈣化，如發(fā)生在軟組織和血管的鈣化，則可能產(chǎn)生重要病理后果。ACC/AHA2007年發(fā)表的臨床指南中，推薦冠脈鈣化積分作為動脈粥樣硬化和心肌梗死的預后指標之一。最近發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊中細胞水平的微鈣化灶可能是易損斑塊破裂的重要原因。在臨床方面，血管鈣化與傳統(tǒng)心血管危險因素，動脈粥樣硬化性血管病變總體負擔密切相關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化與骨的形成過程有

2、關(guān)，是由細胞介導的主動調(diào)節(jié)的過程。血管的管壁細胞尤其是血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在誘導條件下(高磷、高鈣、炎癥因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β，25-羥化膽固醇和高低密度脂蛋白等)均可轉(zhuǎn)分化為成骨樣細胞，合成和分泌多種骨形成蛋白，在細胞外基質(zhì)或胞質(zhì)中形成鈣結(jié)節(jié)。
　　 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患者常見血管鈣化，表現(xiàn)為動脈粥樣硬化斑塊中鈣化灶和血管中膜鈣化

3、并存，與病人的首位死亡原因一心血管終點事件密切相關(guān)。DCCT和UKPDS等研究已經(jīng)證明無論在1型還是2型糖尿病，強化血糖控制只能降低微血管而非大血管并發(fā)癥。因此，探討糖尿病血管鈣化的發(fā)生機制，尋找有效的治療措施具有重要的意義。近年來研究證實蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycated end-products，AGEs)通過受體(receptor forAGEs，RAGE)結(jié)合或非受體途徑影響胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、刺激

4、細胞因子和炎性介質(zhì)釋放、促進胞外基質(zhì)積聚等，在介導高血糖引致糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而AGEs是否可能通過受體途徑促進炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-a,TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等表達參與糖尿病血管鈣化發(fā)生的早期事件值得研究。
　　 PPARγ受體激活劑一噻唑烷二酮由于能增加胰島素敏感性已廣泛用于2型糖尿病的治療。研究證實噻唑

5、烷二酮(如羅格列酮(rosiglitazone，RSG)還具有獨立于降糖作用之外的心血管保護效應(yīng)，但有關(guān)噻唑烷二酮心血管保護作用的藥理機制尚未闡明。本研究從細胞和實驗動物2個水平觀察AGE-BSA對堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，成骨細胞特異性結(jié)合因子(core binding factor a-1，Cbfα-1)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、TNF-α和IL-6的表達分泌以及鈣鹽沉積的影

6、響及其可能的機制;并探討羅格列酮對上述可能影響的干預效應(yīng)。為進一步闡明血管鈣化發(fā)生的病理機制和噻唑烷二酮心血管保護作用的藥理機制提供實驗依據(jù)。
　　 方法： l、運用BSA和葡萄糖體外制備的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-bovine serumalbumin，AGE-BSA)。2、運用AGE-BSA、anti-RAGE中和抗體和羅格列酮分別或共同干預體外鈣化培養(yǎng)的大鼠主動脈VSMCs。3、采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料制

7、備2型糖尿病大鼠模型(DM組)，維生素D3聯(lián)合尼古丁制備動脈鈣化大鼠模型(VDN組)，糖尿病血管鈣化大鼠模型采用小劑量鏈脲佐菌素結(jié)合高能量飼料，同時肌肉注射維生素D3并尼吉丁灌胃(DN+VDN組)，并隨機分為未治療組、RSG治療組和格列本脲(glibenclamide，GLB)治療組。4、硝酸銀(Von Kossa)染色及甲o-酚酞絡(luò)合酮方法檢測鈣鹽沉積。5、磷酸苯二鈉(金氏)法測定ALP活性。6、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)檢測RAG

8、E、Cbfα-1、ALP、OPN及TNF-α、IL-6 mRNA表達。7、蛋白免疫印跡檢測RAGE、Cbfα-I及OPN蛋白表達。8、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測培養(yǎng)細胞上清或?qū)嶒瀯游镅錞NF-α、IL-6。9、熒光分光光度法檢測實驗動物血清AGEs濃度。10、免疫組織化學法檢測實驗動物胸主動脈RAGE及OPN蛋白表達。11、數(shù)據(jù)以-x±S表示，SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用one-wayANOVA進行顯著性檢驗，差異顯著

9、性設(shè)定為P＜0.05。
　　 結(jié)果：1、與BSA組相比，AGE-BSA組VSMCs的RAGE、Cbfα-1、ALP、OPN、TNF-α及IL-6的表達，ALP活性，培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6含量，以及細胞內(nèi)鈣含量明顯增加(p<0.01～0.05)，且細胞內(nèi)鈣含量和ALP活性隨AGE-BSA濃度升高和干預時間延長而增加;2、anti-RAGE中和抗體和RSG分別與AGE-BSA共孵育能抑制AGE-BSA的上述效應(yīng)，且RSG能抑

10、制AGE-BSA誘導的RAGE表達(p＜0.01～0.05)。3、DN+VDN組大鼠血清AGEs、TNF-α和IL-6水平，胸主動脈RAGE、Cbfα-1、ALP、OPN及TNF-α、IL-6的表達及鈣含量明顯高于鈣化組(戶＜0.01～0.05)。4、RSG組血清AGEs TNF噸及IL-6水平低于未治療組和GLB組，(P＜0.05)；RSG組胸主動脈RAGE、Cbfα-1、ALP及OPN表達及鈣含量均低于未治療組和GLB治療組但高于鈣

11、化組(P＜0.05)；與未治療組相比，GLB組上述指標差異無顯著性。
　　 結(jié)論：1、AGEs可能通過RAGE途徑上調(diào)TNF-α、IL-6表達分泌，促進VSMCs鈣化。2、糖尿病大鼠血清AGEs、TNF-α、IL-6水平升高，胸主動脈RAGE、Cbfα-1、ALP和OPN表達及鈣鹽沉積增加。3、羅格列酮減少體內(nèi)AGEs積聚，下調(diào)RAGE表達，降低TNF-α、IL-6水平，抑制Cbfα-1、ALP和OPN表達，減輕糖尿病大鼠胸主動