糖基化終產物介導糖尿病腎病腎臟脂質沉積的分子機制.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 2型糖尿病大鼠腎臟膽固醇代謝異常
　　目的:本實驗的研究目的在于探索T2DM時腎臟脂質沉積的分子機制，以及腎臟脂質沉積能否影響腎臟形態(tài)和功能，最終促進DN的發(fā)生和發(fā)展。
　　方法:SD大鼠適應性喂養(yǎng)1w后，一部分大鼠維持普通飲食(Normal control，NC)，另一部分大鼠給予高脂高糖喂養(yǎng)4w后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，30mg/

2、kg)。72h后，經尾靜脈采血測定隨機血糖，以血糖≥16.7mmol/L確定為T2DM模型造模成功。再將成功造模的T2DM大鼠分為糖尿病組(DM)和阿托伐他汀治療組(10mg/kg/d,DM+AT)。
　　結果:1.DM組大鼠的體重明顯低于NC組大鼠(P＜0.05），腎重/體重(KW/WT)高于NC組大鼠(P＜0.05)，FBG也顯著高于對照組(P＜0.05），并且血脂，包括TG、TC和LDL也比NC組大鼠顯著增高(P＜0.05）

3、。AT治療8w后，與DM組相比，DM+AT組大鼠的體重、KW/WT和FBG改變不明顯（P＞0.05）;血TC和LDL明顯低于DM組(P＜0.05)，但TG改變不明顯(P＞0.05）。3.HE染色顯示，DM組大鼠腎臟出現空泡細胞，尤其在是腎小管上皮細胞，空泡現象比較明顯，而NC組大鼠的腎臟細胞并未發(fā)現空泡變性。進一步油紅O染色發(fā)現，大量被染成橘紅色的脂滴沉積于腎臟，腎小管上皮細胞沉積尤為明顯，腎小球也存在脂質沉積，而對照組大鼠的腎臟未發(fā)現

4、脂滴的形成。與此相比，DM+AT組只有少量的脂滴沉積于腎臟。PAS染色顯示DM組大鼠腎小球系膜基質增生明顯，PASM染色顯示DM組大鼠的腎小球及腎小管基底膜均明顯增厚，而在NC組大鼠的腎組織未有發(fā)現系膜基質增生及基底膜增厚的病理改變。AT治療8 w后，DM+AT組大鼠的腎小球系膜基質增生、腎小球及腎小管基底膜增厚明顯改善。4.Real-time PCR和Western blot結果顯示，與NC組相比，DM組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、

5、LDLr、SREBP-2、SCAP的mRNA和蛋白表達明顯高于NC組(P＜0.05）。AT治療8w后，與DM組相比，DM+AT組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、LDLr和SREBP-2的mRNA和蛋白表達明顯增高(P＜0.05），而SCAP的mRNA和蛋白表達改變不明顯(P＞0.05）。
　　結論:1.T2DM大鼠腎臟存在脂質沉積，而減少腎臟脂質沉積可以明顯改善腎臟組織形態(tài)及功能。2.T2DM大鼠腎臟SCAP-SREBP-2-HMG

6、-CoAR/LDLr膽固醇負反饋調節(jié)通路紊亂，這可能與其腎臟脂質沉積（腎臟實質細胞泡沫化）有關。
　　第二部分 糖基化終產物介導腎臟膽固醇代謝紊亂
　　目的:本研究將進一步探索AGEs是否能夠引起T2DM時腎臟泡沫細胞形成，從而影響腎臟的形態(tài)和功能，最終導致DN。
　　方法:體內實驗:將成功造模的T2DM大鼠分為糖尿病組(DM)和氨基胍治療組(100 mg/kg/d，DM+AG)。代謝籠收集大鼠24 h尿，檢測尿蛋白及

7、u-NGAL。藥物干預8w后，處死各組大鼠并留取血和腎組織標本，檢測血清羧甲基賴氨酸(Carboxy-methyl-lysine，CML)。一部分腎組織制作冰凍切片用于油紅O染色，另一部分腎組織制作石蠟切片用于PAS染色、Masson染色及免疫組化。剩余腎組織用于定量Real-time PCR和Western blot檢測腎組織HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2及SCAP的基因和蛋白表達。
　　結果:體內實驗:1.與NC組

8、相比，DM組大鼠血清CML水平明顯增高（P＜0.05），而DM+AG組大鼠的血清CML明顯低于DM組(P＜0.05）。并且，免疫組化結果顯示，與NC組相比，DM組腎臟的腎小管、腎小球、腎小球系膜、基底膜及腎間質均有CML沉積，但AG干預8w后，與DM組相比，DM+AG組CML沉積明顯減少。2.油紅O染色結果顯示，與DM組相比，DM+AG組大鼠腎臟脂質沉積減少。3.實驗起初，DM組與DM+AG組的24 h尿蛋白總量沒有明顯差異(P＞0.0

9、5）。AG干預4w后，與DM組相比，DM+AG組的24 h尿蛋白總量明顯下降(P＜0.05)。AG繼續(xù)干預8w后，DM+AG組的24 h尿蛋白總量仍然比同期DM組的24 h尿蛋白總量低(P＜0.05）。AG干預8w后，DM+AG大鼠的24h尿u-NGAL含量也明顯降低（P＜0.05）。PAS和PASM染色結果顯示，與DM組相比，DM+AG組大鼠的腎小球系膜基質增生、腎小球及腎小管基底膜增厚明顯改善。4.Real-time PCR和Wes

10、tern blot結果顯示，DM+AG組大鼠腎臟組織HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達也明顯比DM組低(P＜0.05）。
　　結論:1.T2DM時，腎小管上皮細胞泡沫化，SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr膽固醇負反饋調節(jié)通路紊亂，與體內高CML水平有關，這可能是腎臟形態(tài)及功能損傷的原因。2.抑制AGEs(CML)的合成或阻斷CML-RAGE通路，能夠減少腎小管上皮細胞脂質沉積

11、，改善腎臟形態(tài)及功能。
　　第三部分 糖基化終產物通過內質網應激致腎小管上皮細胞膽固醇代謝紊亂
　　目的:本實驗將進一步于探究AGEs能否通過觸發(fā)腎小管上皮細胞ERS，從而引起SCAP和SREBP-2的表達及功能障礙，最終導致腎小管上皮細胞脂質沉積。
　　方法:將HK-2細胞按照不同干預條件分為4組，分別為Ctr組、CML組(給予50μg/mL CML)、CML+4-PBA組(給予50μg/mL CML和5mmol/L

12、4-PBA)、4-PBA組(給予5 mmol/L4-PBA)。干預24h后，用CCK-8試劑盒和AnnexinⅤ-FITC試劑盒分別檢測HK-2細胞活力和凋亡情況，油紅O染色檢測細胞內脂質沉積情況，酶學方法檢測HK-2細胞內CE的水平，Real-time PCR和Western blot檢測HK-2細胞HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2、SCAP、葡萄糖調節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein78，GRP

13、78)及C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的基因和蛋白表達。
　　結果:1.CML干預HK-2細胞24 h后，與Ctr組比較，CML組細胞活力下降(P＜0.05），而CML+4-PBA組較CML組細胞活力有所增加(P＜0.05）;單用4-PBA干預HK-2細胞24 h后，與Ctr組比較，細胞活力改變不明顯(P＞0.05）。CML干預HK-2細胞24h后，HK-2細胞凋亡數量較Ctr組有

14、所增加(P＜0.05)，而CML+4-PBA組較CML組細胞凋亡減少(P＜0.05）;單用4-PBA干預HK-2細胞24 h后，與Ctr組比較，細胞凋亡不明顯(P＞0.05）。2.與Ctr組相比，CML組CE值顯著增加(53.33±11.55μmol/L vs.116.67±32.15μmol/L，P＜0.05); CML+4-PBA組與CML組相比CE值顯著降低(116.67±32.15μmol/L vs.53.33±5.77，P＜0

15、.05);與Ctr組相比，4-PBA組的CE改變不明顯(53.33±11.55μmol/L vs.53.33±5.77肛mol/L，P＞0.05)。油紅O染色結果顯示有CML存在時，細胞內的紅染脂滴顯著增多，而CML+4-PBA組的紅染脂滴明顯比CML組減少;4-PBA組的HK-2細胞內并未發(fā)現紅染脂滴。3.Real-time PCR和Western blot結果顯示，CML組HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRN

16、A和蛋白表達明顯比Ctr組高(P＜0.05)，而CML+4-PBA組HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達明顯比CML組低(P＜0.05);4-PBA組與Ctr組相比HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表達沒有明顯改變(P＞0.05）。CML組GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達明顯比Ctr組高(P＜0.05)，而CML+4-PBA組GRP78和CHOP的mRNA和蛋

17、白表達明顯比CML組低(P＜0.05);4-PBA組與Ctr組相比GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達沒有明顯改變(P＞0.05）。
　　結論:1.腎小管上皮細胞泡沫化，SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr膽固醇負反饋調節(jié)通路紊亂，這可能是由CML觸發(fā)腎小管上皮細胞ERS有關。2.而抑制ERS可以明顯改善CML引起的膽固醇負反饋調節(jié)通路的紊亂，從而減少腎小管上皮細胞脂質沉積。
　　總結:T2DM時，體內增