葉酸對(duì)糖尿病大鼠腎臟高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物與受體及腎功能的影響.pdf

1、背景與目的： 糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，仍缺乏系統(tǒng)有效的防止措施，已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。在糖尿病高糖環(huán)境下產(chǎn)生的高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物與其受體在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物主要是通過(guò)與其受體RAGE、P60、P90、galectin-3、清道夫受體、CD36等結(jié)合作用導(dǎo)致了腎小球的損傷從而參與了糖尿病腎病的發(fā)病。RAGE，是細(xì)胞表面分子，屬于免疫球蛋白超家

2、族成員，Galectin-3，屬于半乳糖苷結(jié)合凝集素家族，它與P60、P90共同組成了AGEs的受體復(fù)合物，二者均為AGEs的受體，與AGEs結(jié)合在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。高同型半胱氨酸血癥是糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素之一，并且高同型半胱氨酸血癥往往伴有葉酸、維生素B12等的缺乏，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸可以降低糖尿病的高同型半胱氨酸血癥。但對(duì)于糖尿病腎病病例補(bǔ)充葉酸后，是否會(huì)對(duì)高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物及其受體產(chǎn)生一定的作用尚不完全清楚，因

3、此，本課題設(shè)計(jì)在糖尿病大鼠模型中補(bǔ)充葉酸來(lái)觀察其對(duì)糖尿病腎臟的糖基化終末產(chǎn)物及受體的影響，為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療提供新的思路和啟示。 方法： 1、研究對(duì)象：Wister雄性大鼠，50只，體重在200-250g，除正常對(duì)照組(N組，9只)外，其余45只大鼠為實(shí)驗(yàn)組，給予鏈脲佐菌素單次腹腔注射，誘發(fā)糖尿病模型。正常對(duì)照組給予同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。然后將成模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為DM組(糖尿病組，19只)和FA組(

4、葉酸治療組，19只)。 2、研究方法：①動(dòng)物成模2周后FA組給予葉酸5.0mg/Kg體重灌服，N組和DM組分別給予同等體積的生理鹽水灌服。②大鼠每周測(cè)定隨機(jī)體重與血糖。③8周末測(cè)定大鼠血尿素氮、肌酐、糖化血紅蛋白、尿24小時(shí)蛋白，并計(jì)算出尿素氮/肌酐比值與肌酐清除率。③AGEs測(cè)定將液氮中的腎組織制成3μm冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察，記錄曝光時(shí)間，以此間接反映腎組織AGEs含量。④采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎臟組織切片中的RAGE

5、、galectin-3的表達(dá)。采用MCIDAnalysisEvaluation7.0圖像分析軟件，測(cè)量切片陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值和陽(yáng)性細(xì)胞率。 3、統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。樣本均數(shù)組間的比較用One-WayANOVA(單因素方差分析)方法，方差齊性用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)(Q檢驗(yàn))，方差不齊用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。上述統(tǒng)計(jì)過(guò)程均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

6、 結(jié)果： 1、大鼠隨機(jī)血糖與體重測(cè)定：DM組和FA組糖尿病大鼠在病程第4、6、8周，血糖較N組明顯升高(P＜0.01)，體重下降(P＜0.01或P＜0.05)，糖尿病大鼠兩組間相比，血糖及體重均無(wú)明顯差別(P＞0.05)。 2、血、尿生化指標(biāo)：在病程8周時(shí)FA組、DM組同N組比較血中尿素氮、尿素氮/肌酐、糖化血紅蛋白、尿24h蛋白均明顯升高(P＜0.01)，肌酐清除率明顯下降(P＜0.01或P＜0.05)，而血肌酐未有明

7、顯差別。兩組糖尿病大鼠之間比較發(fā)現(xiàn)FA組24小時(shí)尿蛋白比DM組明顯降低(P＜0.01)，其余指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差別。 3、腎臟中AGEs的熒光測(cè)定分析：在病程8周時(shí)N組的腎組織AGEs熒光強(qiáng)度最低(曝光時(shí)間最長(zhǎng))，DM組與N組比較熒光強(qiáng)度明顯增高(P＜0.01)；FA組的AGEs熒光強(qiáng)度較N組亦明顯升高(P＜0.01)，但較DM組明顯降低(P＜0.01)。 4、腎臟中g(shù)alectin-3的表達(dá)分析：(1)定位表達(dá)：①N組大鼠

8、8周末在腎小球未檢測(cè)到galectin-3的表達(dá)，而DM組和FA組均在8周末檢測(cè)到galectin-3的表達(dá)。②N組、DM組和FA組8周末在腎小管均可檢測(cè)到galectin-3的表達(dá)。(2)定量分析：①FA組糖尿病大鼠同DM組比較8周末腎小球galectin-3染色陽(yáng)性細(xì)胞率及光密度值明顯升高(P＜0.05)。②8周末，糖尿病大鼠腎小管galectin-3染色陽(yáng)性細(xì)胞率及光密度值均比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，而且FA組比DM組

9、腎小管陽(yáng)性細(xì)胞率及光密度值明顯升高(P＜0.05)。 5、腎臟中RAGE的表達(dá)分析：(1)定位表達(dá)：各組大鼠腎小管在8周末均未檢測(cè)到RAGE，而在腎小球均可檢測(cè)到RAGE。(2)定量分析：①糖尿病大鼠腎小球中RAGE染色陽(yáng)性細(xì)胞率及光密度值均比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，但FA組比DM組腎小球陽(yáng)性細(xì)胞率及光密度值明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、葉酸治療對(duì)糖尿病大鼠隨機(jī)血糖與體重變化以及血中尿素氮、