糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人角膜上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的:角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲是目前眼科臨床常見(jiàn)的糖尿病眼部并發(fā)癥之一，治療棘手，發(fā)生機(jī)制尚不清楚。糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)是在持續(xù)高糖條件下，蛋白質(zhì)的氨基與糖的醛基在非酶催化反應(yīng)下生成的終產(chǎn)物，與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。AGEs促進(jìn)ROS的生成，而ROS可通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此本課題通過(guò)研究AGEs對(duì)THCEs凋亡作用及其與ROS的關(guān)系，探討AGEs在糖尿病

2、角膜創(chuàng)傷愈合延遲中的作用機(jī)制。
　　 研究方法:利用牛血清白蛋白(BSA)和葡萄糖體外制備AGE-BSA及其對(duì)照物。體外培養(yǎng)THCE細(xì)胞與不同濃度（50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml）的AGEs修飾牛血清白蛋白(AGE-BSA)在體外共同培養(yǎng)不同時(shí)間(6h，12h，24h，48h)。應(yīng)用Annexin(V)-Fitc和碘化丙啶(PI)與細(xì)胞共同孵育，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并定量分析細(xì)胞凋亡百分率;采

3、用Westemblot檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)。選用刺激效果最好的AGE-BSA濃度和作用時(shí)間，抗氧化劑NAC(20μmol/L)預(yù)先作用1小時(shí)清除內(nèi)源性ROS或NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μM)和Apocynin（300μM）孵育1小時(shí)抑制NADPH氧化酶后，實(shí)驗(yàn)分為9組:空白對(duì)照組、BSA對(duì)照組、AGE-BSA組、AGE-BSA+NAC組、AGE-BSA+DPI組、AGE-BSA+Apocynin組、DPI組、A

4、pocynin組、NAC組，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。選用刺激效果最好的AGE-BSA濃度和作用時(shí)間，用NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μM)和Apocynin（300μM）抑制NADPH氧化酶后，實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為空白對(duì)照組、BSA對(duì)照組、AGE-BSA組、AGE-BSA+DPI組、AGE-BSA+Apocynin組，用Westemblot檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)分析THCEs凋亡率結(jié)果

5、顯示:200μg/mlAGE-BSA刺激細(xì)胞6h，凋亡細(xì)胞明顯增加(P＜0.05)，24h達(dá)高峰(P＜0.05)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BSA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比凋亡率改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50μg/mlAGE-BSA能夠明顯刺激THCE細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，100μg/ml，200μg/ml和400μg/mlAGE-BSA均能夠顯著增加角膜上皮細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BSA對(duì)照組與空白對(duì)照組相

6、比凋亡率改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot結(jié)果顯示:200ug/mlAGE-BSA刺激THCE細(xì)胞6h，12h，24h，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，12h達(dá)高峰(P＜0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，24h最明顯(P＜0.05)。分別用ROS清除劑NAC清除ROS，NADPH氧化酶抑制劑DPI、Apocynin抑制NADPH氧化酶從而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成后，AGE-BSA200ug/ml刺激THCE細(xì)胞24h，流式結(jié)果顯示，與AGE

7、-BSA組相比，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與空白對(duì)照組及BSA對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑DPI、Apocynin抑制NADPH氧化酶從而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成后，AGE-BSA200ug/ml刺激THCE細(xì)胞24h，Westernblot檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)降低，與AGE-BSA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與空白對(duì)照組及BSA對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義