糖基化終末產(chǎn)物對(duì)角膜上皮創(chuàng)傷愈合的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 隨著人民生活水平的提高、生活方式的改變和人口老齡化，我國(guó)糖尿病發(fā)病率呈明顯的逐年增高趨勢(shì)。糖尿病已經(jīng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅人類健康的世界性問(wèn)題。糖尿病患者在角膜外傷或接受角膜手術(shù)時(shí)極易出現(xiàn)角膜上皮愈合延遲甚至不愈，臨床表現(xiàn)為:持續(xù)性角膜上皮損失、反復(fù)性角膜上皮糜爛、淺層角膜潰瘍形成、繼發(fā)嚴(yán)重角膜感染甚至失明。目前尚沒(méi)有有效的治療方法。因此，研究糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的發(fā)病機(jī)制和防治措施(已)成為眼科亟待解決的課題。

2、r>　　 研究發(fā)現(xiàn)，持久的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致糖尿病患者體內(nèi)多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)甚至核酸發(fā)生糖基化反應(yīng)，形成具有結(jié)構(gòu)多樣、高度活性的糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)。正常情況下體內(nèi)AGEs的水平隨年齡的增長(zhǎng)而緩慢增加，而在糖尿病患者體內(nèi)，病理性高血糖可加速糖基化反應(yīng)，形成大量的AGEs，并在組織中蓄積。AGEs具有不可逆性，這使其在高血糖被糾正后也不能回復(fù)到正常水平。AGEs具有廣泛的生物學(xué)

3、活性，參與了多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。隨著對(duì)AGEs研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)AGEs與糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合延遲密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，AGEs大量蓄積在糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物模型的角膜上皮及基底膜中，但其是否參與角膜上皮創(chuàng)傷愈合過(guò)程而導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合延遲？目前尚不清楚。因此，深入研究AGEs在角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲中的作用，將進(jìn)一步揭示糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的機(jī)制，為其防治提供新的理論依據(jù)。
　　 AGEs與細(xì)胞表面特異性受體(re

4、ceptorforadvancedglycationendproducts，RAGE)結(jié)合，能夠增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)的生成，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，造成組織氧化損傷。RAGE作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，介導(dǎo)AGEs結(jié)合在細(xì)胞表面，激活細(xì)胞內(nèi)各種轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。研究證實(shí)RAGE在正常單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，但在糖尿病條件下其表達(dá)明顯增加。AGEs與RAG

5、E表達(dá)之間存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，AGEs蓄積的病變部位往往伴隨著RAGE表達(dá)的增加。ROS是指化學(xué)性質(zhì)活躍的氧代謝產(chǎn)物或由其衍生的產(chǎn)物，主要有超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等。ROS生成過(guò)多將在細(xì)胞內(nèi)形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)氧化反應(yīng)破壞許多重要生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展。
　　 目前關(guān)于AGEs對(duì)角膜上皮創(chuàng)傷愈合的影響及機(jī)制研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。AGEs是否延遲角膜上皮創(chuàng)傷愈合過(guò)程？是否通過(guò)受體RAGE及ROS發(fā)

6、揮作用？具體機(jī)制如何？回答這些問(wèn)題將從根本上揭示AGEs在糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲中的作用及機(jī)制，不僅對(duì)理解糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲病理機(jī)制具有重要的意義，也必將為糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的防治提供新理論、新視角和新靶點(diǎn)。因此，本研究以體外制備的糖基化終末產(chǎn)物(AGE-BSA)作為干預(yù)因素，觀察AGE-BSA對(duì)人永生化角膜上皮細(xì)胞(Humantelomerase-immortalizedcomealepithelialcells，

7、THCE)RAGE、ROS表達(dá)的影響并研究其機(jī)制，探討AGE-BSA對(duì)THCE細(xì)胞增殖、遷移以及角膜上皮創(chuàng)傷愈合的影響及機(jī)制。全文共分三部分:（一）AGE-BSA對(duì)THCE細(xì)胞RAGE及ROS表達(dá)的影響;（二）AGE-BSA誘導(dǎo)THCE細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制的研究;（三）AGE-BSA對(duì)THCE細(xì)胞增殖、遷移及角膜上皮創(chuàng)傷愈合的影響。
　　 第一部分
　　 糖基化終末產(chǎn)物對(duì)角膜上皮細(xì)胞糖基化終末產(chǎn)物受體及活性氧表達(dá)的影響

8、>　　 目的:研究AGEs對(duì)THCE細(xì)胞RAGE及ROS表達(dá)的影響。
　　 方法:1.用D-葡萄糖和牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)共同孵育10周制備糖基化終末產(chǎn)物(AGE-BSA)。
　　 2.分別用濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的AGE-BSA處理THCE細(xì)胞24h和濃度為200μg/ml的AGE-BSA分別處理THCE細(xì)胞6h、12h、24h

9、、48h。Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)RAGEmRNA和蛋白的表達(dá);
　　 3.分別用濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的AGE-BSA處理THCE細(xì)胞12h。預(yù)先應(yīng)用anti-RAGE中和抗體處理THCE細(xì)胞1h，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育細(xì)胞12h，激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.體外制備的AGE-BS

10、A的熒光強(qiáng)度為55.96熒光單位/mg蛋白，而B(niǎo)SA的熒光強(qiáng)度為1.98熒光單位/mg蛋白。
　　 2.未經(jīng)干預(yù)的THCE細(xì)胞表達(dá)少量的RAGEmRNA和蛋白，用BSA干預(yù)后RAGEmRNA和蛋白的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，濃度為50μg/ml的AGE-BSA明顯上調(diào)THCE細(xì)胞RAGEmRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，隨著AGE-BSA濃度的增加，RAGEmRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增高，AGE-BSA濃度為200

11、μg/ml時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)。
　　 3.在濃度為200μg/ml的AGE-BSA作用下，AGE-BSA作用THCE細(xì)胞6h明顯上調(diào)RAGEmRNA的表達(dá)(P＜0.05)，AGE-BSA作用THCE細(xì)胞12h明顯上調(diào)RAGE蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，隨著AGE-BSA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RAGEmRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增高，AGE-BSA作用時(shí)間為24h時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)。
　　 4.未經(jīng)干預(yù)的THCE細(xì)胞

12、表達(dá)極少量的ROS，用BSA干預(yù)后ROS的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，濃度為100μg/ml的AGE-BSA明顯上調(diào)THCE細(xì)胞ROS的表達(dá)(P＜0.05)，隨著AGE-BSA濃度的增加，ROS的表達(dá)逐漸增高，AGE-BSA濃度為200μg/ml時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)。
　　 5.anti-RAGE中和抗體阻斷AGE-BSA與RAGE結(jié)合后，顯著抑制AGE-BAS對(duì)ROS表達(dá)的上調(diào)作用(P＜0.05)。
　　

13、 結(jié)論:1.AGE-BSA顯著增加THCE細(xì)胞RAGEmRNA、蛋白及ROS的表達(dá)。
　　 2.AGE-BSA通過(guò)與受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)THCE細(xì)胞大量生成ROS，導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞氧化損傷，可能參與糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲過(guò)程。
　　 關(guān)鍵詞:AGEs;THCE細(xì)胞;RAGE;ROS
　　 第二部分
　　 糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制的研究
　　 目的:探討AGEs誘導(dǎo)THCE

14、細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　 方法:1.預(yù)先應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑apocynin及Diphenyleneiodonium(DPI)、線粒體酶復(fù)合體Ⅰ抑制劑rotenone、線粒體酶復(fù)合體Ⅱ抑制劑thenoyltrifluoroacetone(TTFA)、線粒體酶復(fù)合體Ⅲ抑制劑antimycinA、黃嘌呤氧化酶抑制劑allopurinol處理THCE細(xì)胞1h后，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育細(xì)胞12h，應(yīng)用流式

15、細(xì)胞儀檢測(cè)ROS的表達(dá)。
　　 2.預(yù)先應(yīng)用anti-R(A)GE中和抗體處理THCE細(xì)胞lh，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育細(xì)胞12h，應(yīng)用Real-timePCR檢測(cè)NADPH氧化酶亞基p22phox、NOX4mRNA的表達(dá);Westernblot檢測(cè)p22phox、NOX4蛋白的表達(dá)。
　　 3.預(yù)先應(yīng)用anti-RAGE中和抗體處理THCE細(xì)胞1h，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育細(xì)

16、胞12h，檢測(cè)抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)的活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。
　　 結(jié)果:1.與對(duì)照組相比，AGE-BSA顯著上調(diào)THCE細(xì)胞ROS的表達(dá)(P＜0.05)，NADPH氧化酶抑制劑apocynin和DPI顯著抑制AGE-BAS對(duì)ROS表達(dá)的上調(diào)作用(P＜0.05)，而線粒體酶復(fù)合體抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑

17、制劑對(duì)ROS的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 2.與對(duì)照組相比，AGE-BSA明顯上調(diào)THCE細(xì)胞p22phox、NOX4mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，應(yīng)用anti-RAGE中和抗體阻斷AGE-BSA與RAGE結(jié)合后，顯著抑制AGE-BAS對(duì)p22phox、NOX4mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)作用(P＜0.05)。
　　 3.與對(duì)照組相比，AGE-BSA顯著降低THCE細(xì)胞SOD和CAT的活性(P＜0.05);應(yīng)用anti-

18、RAGE中和抗體阻斷AGE-BSA與RAGE結(jié)合后，顯著減輕AGE-BAS對(duì)SOD和CAT活性的抑制作用(P＜0.05)。
　　 4.與對(duì)照組相比，AGE-BSA顯著增加THCE細(xì)胞MDA的含量(P＜0.05);應(yīng)用anti-RAGE中和抗體阻斷AGE-BSA與RAGE結(jié)合后，顯著抑制AGE-BAS對(duì)MDA含量的上調(diào)作用（P＜0.05）
　　 結(jié)論:1.AGE-BSA通過(guò)與受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)THCE細(xì)胞NADPH氧化

19、酶亞基p22phox、NOX4mRNA和蛋白高表達(dá)，促使NADPH氧化酶激活，生成大量ROS。
　　 2.AGE-BSA通過(guò)與受體RAGE結(jié)合，降低THCE細(xì)胞抗氧化酶SOD和CAT的活性、增加MDA的含量，導(dǎo)致氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，促使角膜上皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 關(guān)鍵詞:AGEs;ROS;NADPH氧化酶;氧化應(yīng)激
　　 第三部分
　　 糖基化終末產(chǎn)物對(duì)角膜上皮細(xì)胞增殖、遷移及角膜上皮創(chuàng)傷愈合

20、的影響
　　 目的:探討AGEs對(duì)THCE細(xì)胞增殖、遷移及角膜上皮創(chuàng)傷愈合的影響。
　　 方法:1.分別用濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的AGE-BSA與THCE細(xì)胞共培養(yǎng)24h，CCK-8法檢測(cè)THCE細(xì)胞增殖能力;刮痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)THCE細(xì)胞遷移能力。
　　 2.預(yù)先應(yīng)用anti-RAGE中和抗體、抗氧化劑乙酰半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC

21、)處理THCE細(xì)胞1h，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育細(xì)胞24h，CCK-8法檢測(cè)THCE細(xì)胞增殖能力;刮痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)THCE細(xì)胞遷移能力。
　　 3.體外培養(yǎng)豬角膜上皮創(chuàng)傷器官模型，在角膜中央制作直徑為5mm的上皮損傷區(qū)域。預(yù)先應(yīng)用anti-RAGE中和抗體、抗氧化劑NAC處理1h，再用濃度為200μg/ml的AGE-BSA孵育48h，觀察角膜上皮創(chuàng)傷愈合程度。
　　 結(jié)果:1.與對(duì)照組相比，濃度為5

22、0μg/ml的AGE-BSA顯著抑制THCE細(xì)胞的增殖、遷移(P＜0.05)，隨著AGE-BSA濃度的增加，細(xì)胞增殖、遷移能力逐漸降低，AGE-BSA濃度為200μg/ml時(shí)達(dá)到最低。anti-RAGE中和抗體、NAC顯著減輕AGE-BAS對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用。
　　 2.與對(duì)照組相比，濃度為200μg/ml的AGE-BSA顯著延遲體外培養(yǎng)豬角膜上皮創(chuàng)傷器官模型中角膜上皮創(chuàng)傷愈合過(guò)程(P＜0.05)，anti-RAGE中和

23、抗體、NAC可顯著促進(jìn)角膜上皮創(chuàng)傷的愈合(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.AGE-BSA顯著抑制THCE細(xì)胞增殖、遷移，并且呈濃度依賴性。
　　 2.AGE-BSA通過(guò)與受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)ROS大量生成，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而抑制THCE細(xì)胞增殖、遷移，延遲角膜上皮創(chuàng)傷愈合過(guò)程。阻斷AGE-BSA與RAGE結(jié)合，或清除過(guò)多的ROS，可成為防治糖尿病角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的新途徑。
　　 關(guān)鍵詞:AGEs;增殖