糖基化終末產(chǎn)物通過誘導(dǎo)海馬CTGF表達(dá)對APP、Aβ代謝的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。AD的特征性病理改變是在特定腦區(qū)形成老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元和突觸缺失。Β淀粉樣蛋白(Beta-Amyloid protein,Aβ)是老年斑的主要成分,由淀粉樣前體蛋白(amyloid-β precursorp rotein,APP)裂解產(chǎn)生。近年來研究表明,APP的代謝異常及Aβ生成增加是AD

2、發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。雖然國內(nèi)外學(xué)者在APP異常代謝和Aβ生成的調(diào)控機(jī)制研究方面取得了突破性的進(jìn)展,但具體機(jī)制還不明確。因此,深入研究APP的代謝調(diào)控路徑仍然是一項(xiàng)迫切需要解決的課題,對推動AD的發(fā)病機(jī)制及防治研究進(jìn)展具有重要意義,這也是本課題的立項(xiàng)出發(fā)點(diǎn)。
　　 糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是蛋白質(zhì)非酶糖化的終末不可逆聚合物,正常情況下體內(nèi)AGEs的水平隨增齡而緩慢增加,

3、而腦組織是代謝最活躍的器官之一,其能量代謝完全依賴有氧氧化,腦組織中活性糖增加易于發(fā)生糖化修飾促使AGEs增加。Castellani[1]等研究證實(shí)早期AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元有AGEs存在,隨病程進(jìn)展AGEs的增多與腦內(nèi)Aβ沉積和老年斑數(shù)量呈正相關(guān),提示AGEs增加貫穿AD的整個發(fā)病過程;Münch[2]等用AGEs抑制劑替尼司坦(Tenilsetam)治療AD患者,結(jié)果顯示該藥可使AD患者的認(rèn)知功能改善,上述研究支持AGEs是參與AD發(fā)生

4、和發(fā)展的重要因素。
　　 結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)是一種由多種細(xì)胞表達(dá)和分泌的相對分子質(zhì)量為36000～38000的有絲分裂原多肽,正常生理情況下體內(nèi)的CTGF表達(dá)很低或無表達(dá),在病理情況下,CTGF過度表達(dá)與某些增生性或纖維化性疾病的發(fā)生密切相關(guān),如視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化、腎纖維化、肺纖維化、肝硬化和慢性胰腺纖維化[3-9]等。2003年Ueberham[1

5、0]等應(yīng)用免疫組化技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)如內(nèi)嗅區(qū)、海馬和顳葉CTGF表達(dá)明顯增加,鄰近老年斑的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CTGF表達(dá)也明顯增加并與神經(jīng)原纖維纏結(jié)病變呈正相關(guān),而正常老年人腦內(nèi)神經(jīng)元表達(dá)低水平的CTGF,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)CTGF,提示CTGF與AD老年斑形成和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等病理改變有關(guān)。國內(nèi)外多項(xiàng)研究[11,12,13]表明,AGEs作用其受體RAGE能明顯上調(diào)多種培養(yǎng)細(xì)胞和組織器官中CTGF表達(dá),參與血管、腎臟、視網(wǎng)膜

6、等靶器官損害。Zhao[14]等根據(jù)顯示CTGF可通過MAPK/PI-3/AKT途徑調(diào)控APP代謝并促進(jìn)Aβ生成,是參與AD發(fā)病過程的重要細(xì)胞因子;然而,在AD患者腦中CTGF表達(dá)增強(qiáng)的原因尚不清楚,而CTGF對APP代謝影響在AD發(fā)病過程中的地位也并不十分明了。AGEs及其受體RAGE對腦組織內(nèi)CTGF表達(dá)的影響及APP異常代謝的作用尚未見報道。
　　 因此,探討AGEs通過作用其受體誘導(dǎo)CTGF表達(dá)及其與APP代謝、Aβ生成

7、的相關(guān)性和可能的信號通路,為揭示AD發(fā)病機(jī)制及選擇治療靶點(diǎn)提供依據(jù),具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
　　 目的：
　　 (1)探討糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響。
　　 (2)探討CTGF與海馬神經(jīng)元內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)代謝的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制。
　　 (3)明確AGEs-RAGE-CTGF通路在AD病理變化中的作用。
　　 方

8、法
　　 70只Wistar大鼠隨機(jī)分為7組(各組n=10),各組用微量注射泵海馬內(nèi)注射法制造動物損傷模型:正常對照組(NC組,注射生理鹽水,每側(cè)4μl)、牛血清白蛋白對照組(BSA-C組,注射牛血清蛋白,每側(cè)4μl)、糖基化修飾的牛血清白蛋白組(AGE-BSA組,注射AGE-BSA,每側(cè)4μl)、RAGE中和抗體組(RAGE-Ab組,先注射單克隆中和抗體RAGE-Ab,每側(cè)2μl,15分鐘后再注射AGE-BSA,每側(cè)4μL)、

9、RAGE中和抗體對照組(RAGE-Ab-C組,注射RAGE中和抗體,每側(cè)4μl)、CTGF中和抗體組(CTGF-Ab組,先注射單克隆中和抗體CTGF-Ab,每側(cè)2μl,15分鐘后再注射AGE-BSA,每側(cè)4μL)、CTGF中和抗體對照組(CTGF-Ab-C組,注射CTGF中和抗體,每側(cè)4μl)。3周后:通過HE染色檢測海馬區(qū)神經(jīng)元病理改變:通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠逃逸潛伏期(EL);通過免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠海馬TGF-

10、β1、CTGF、BACE1、PS-1、IDE、APP和Aβ42蛋白表達(dá);通過Western blot檢測大鼠海馬RAGE、TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1和IDE蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
　　 AGE-BSA組逃避潛伏期較NC組、BSA-C組、RAGE-Ab-C組和CTGF-Ab-C組明顯延長(P＜0.01);RAGE-Ab組和CTGF-Ab組逃避潛伏期較NC組延長(

11、P＜0.05);RAGE-Ab組和CTGF-Ab組逃避潛伏期較AGE-BSA組縮短(P＜0.05);NC組、BSA-C組、RAGE-Ab-C組和CTGF-Ab-C組之間逃避潛伏期無明顯差別。
　　 2.免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠海馬TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、IDE、APP和Aβ42蛋白表達(dá)
　　 NC組、BSA-C、RAGE-Ab-C組和CTGF-Ab-C組之間TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-

12、1、IDE、APP和Aβ42蛋白著色無明顯差異;在AGE-BSA組大鼠的大腦海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi):TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1、APP和Aβ42著色呈棕黃色,顏色灰度明顯高于NC組;而RAGE-Ab組和CTGF-Ab組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)上述指標(biāo)顏色灰度較AGE-BSA組明顯減弱;AGE-BSA組海馬神經(jīng)元內(nèi)IDE表達(dá)減少,顏色灰度低于NC組,RAGE-Ab組和CTGF-Ab組較AGE-BSA組表達(dá)增多,著色較深。
　　

13、3.Western blot檢測各組大鼠海馬RAGE、TGF-β1、CTGF、BACE1、PS-1和IDE蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析
　　 (1)AGE-BSA組RAGE、TGF-β1蛋白表達(dá)明顯高于NC組(P＜0.01),分別是NC組的1.4倍和2倍;與AGE-BSA組比較,RAGE-Ab組RAGE、TGF-β1蛋白表達(dá)明顯減少,下降率分別為7％和9％(P＜0.05);NC組、BSA-C組、RAGE-Ab-C組之間RAGE、TG

14、F-β1蛋白表達(dá)無顯著性差異。提示AGE能上調(diào)海馬組織RAGE、TGF-β1蛋白表達(dá)。
　　 (2)AGE-BSA組CTGF蛋白表達(dá)相對指數(shù)為0.76,是NC組CTGF蛋白表達(dá)系數(shù)的1.9倍(P＜0.01);與AGE-BSA組比較,RAGE-Ab組CTGF蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05);NC組、BSA-C組、RAGE-Ab-C組之間CTGF蛋白表達(dá)無顯著性差異。提示AGE通過作用RAGE上調(diào)海馬組織CTGF的蛋白表達(dá)。

15、　　 (3)AGE-BSA組BACE1、PS-1蛋白表達(dá)系數(shù)分別為(0.76、0.74);是NC組BACE1、PS-1蛋白表達(dá)系數(shù)(0.50、0.44)的1.5倍和1.7倍(P＜0.01);而RAGE-Ab組和CTGF-Ab組BACE1、PS-1蛋白較AGE-BSA組表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合免疫組化結(jié)果提示AGE部分通過RAGE及CTGF通路上調(diào)海馬組織BACE1、PS-1的表達(dá),影響Aβ生成。
　　

16、(4)AGE-BSA組IDE表達(dá)減少,明顯低于NC組(P＜0.01),RAGE-Ab組和CTGF-Ab組較AGE-BSA組表達(dá)增多(P＜0.05)。提示AGE部分通過上調(diào)RAGE及CTGF表達(dá)抑制海馬組織IDE的活性,減少Aβ降解。
　　 結(jié)論：
　　 1.糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)通過與其受體(RAGE)結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)結(jié)締組織生長因子(CTGF)的高表達(dá)。

17、r>　　 2.結(jié)締組織生長因子(CTGF)可通過影響APP代謝酶(β-分泌酶、γ-分泌酶、胰島素降解酶)的作用參與APP的異常代謝、促進(jìn)Aβ42的生成。
　　 3.AGEs-RAGE-CTGF通路上調(diào)可能是海馬區(qū)神經(jīng)元損傷的重要途徑,可能將成為阿爾茨海默病(AD)的又一發(fā)病機(jī)制。
　　 意義
　　 本研究擬用立體定位技術(shù)給大鼠雙側(cè)海馬區(qū)內(nèi)注射AGEs,建立AGEs動物損傷模型,用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法觀察AG