糖基化終產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)與活性的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、在高血糖的條件下，許多生物大分子會(huì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生糖基化終產(chǎn)物(AdvancedGlycationEndProducts，AGEs)，大量蓄積于體內(nèi)并沉積于血管壁。近年大量研究證明，糖基化終產(chǎn)物在糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病中起重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，尤其是與斑塊破裂導(dǎo)致的臨床事件有密切關(guān)系。然而，糖基化終產(chǎn)物與基質(zhì)金屬蛋白酶的相關(guān)研究較少。 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察糖基化終產(chǎn)物作用后的巨噬細(xì)胞的形態(tài)

2、變化并測(cè)定MMP-9活性、表達(dá)改變，來(lái)研究糖基化終末產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞活化及其與斑塊破裂的關(guān)系；并根據(jù)他汀類藥物的可阻斷類異戊二烯途徑的特性，結(jié)合類異戊二烯中間產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)的觀察，用以確證類異戊二烯通路是否參與了AGE對(duì)巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的誘導(dǎo)過(guò)程。 方法:體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，分別以不同濃度BSA-AGE(0、50、100、200、400mg/L)作用48h；以相同濃度BSA-AGE(400mg/L)作用不同時(shí)間(0、1

3、2、24、36、48h)；在BSA-AGE(400mg/L)培養(yǎng)條件下，不同濃度的辛伐他汀(5μmoL/L，50μmol/L)作用48h；以及BSA-AGE(400mg/L)與辛伐他汀(50μmol/L)培養(yǎng)條件下，GGPP(10μmol/L)作用48h。提取培養(yǎng)液上清，采用明膠酶譜法測(cè)定MMP-9活性；通過(guò)Westernblot法檢測(cè)MMP-9表達(dá)。圖像光密度掃描后，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果不同濃度BSA-AGE作用后，巨噬細(xì)胞MM

4、P-9活性/表達(dá)增強(qiáng)，呈劑量依賴效應(yīng)；BSA-AGE作用不同時(shí)間時(shí)，巨噬細(xì)胞MMP-9活性/表達(dá)增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴效應(yīng)；辛伐他汀可明顯降低MMP-9活性/表達(dá)；GGPP可明顯逆轉(zhuǎn)辛伐他汀的作用，使一度被抑制的MMP-9活性/表達(dá)得以恢復(fù)。 討論慢性高血糖可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖基化，形成AGEs。一方面，加速交聯(lián)蛋白不斷沉積于血管基底膜上，形成糖尿病特征性血管病變；另一方面，AGEs與細(xì)胞表面的AGEs受體結(jié)合，釋放各種細(xì)胞因子，

5、導(dǎo)致糖尿病性大血管病變的進(jìn)展。糖尿病患者血漿糖基化終產(chǎn)物濃度多在100mg/L-400mg/L之間，本實(shí)驗(yàn)所采用的糖基化終產(chǎn)物濃度分別為50mg/L、100mg/L、200mg/L及400mg/L，基本符合人體的病理?xiàng)l件。 基質(zhì)金屬蛋白酶能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂處MMP-9表達(dá)明顯增加，是加速動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展的重要因素之一。同時(shí)有報(bào)道表明，糖基化終產(chǎn)物多

6、分布于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊好發(fā)處。本研究結(jié)果顯示，糖基化終產(chǎn)物可在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9活性與表達(dá)，呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)。本研究從體外實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)了糖基化終產(chǎn)物刺激基質(zhì)金屬蛋白酶9分泌，參與了糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)展。 以往的研究文獻(xiàn)提示糖基化終產(chǎn)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與小G蛋白密切相關(guān)。小G蛋白在胞漿中為無(wú)活性形式，經(jīng)脂?；箦^定到細(xì)胞膜表面才發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。而小G蛋白的脂酰化離不開(kāi)類異戊二烯中間產(chǎn)

7、物。本實(shí)驗(yàn)表明，類異戊二烯途徑抑制劑辛伐他汀可以明顯降低BSA-AGE誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MMP-9分泌/活性，類異戊二烯中間產(chǎn)物可逆轉(zhuǎn)辛伐他汀的抑制效應(yīng)，提示糖基化終產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的誘導(dǎo)效應(yīng)與類異戊二烯通路有關(guān)。 總之，糖基化終產(chǎn)物在體外可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性，這可能是糖尿病性的病變形成與進(jìn)展的機(jī)制之一，提示對(duì)糖基化終產(chǎn)物的干預(yù)可作為糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化新的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果還提示糖基化終產(chǎn)物