晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的低密度脂蛋白對(duì)肥大細(xì)胞活性影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：糖尿病(Diabetes，DT)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的主要危險(xiǎn)因素，其高血糖癥導(dǎo)致的晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的低密度脂蛋白(Advancedglycationendproductmodifiedlowdensitylipoprotein，AGE-LDL)在體內(nèi)的沉積促進(jìn)了AS的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，肥大細(xì)胞活性與AS的形成和發(fā)展及斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。盡管未見相關(guān)報(bào)道，AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞活性的影

2、響可能是DT患者易患AS和易發(fā)急性心血管事件的重要病因。
　　 研究目的：本研究用AGE-LDL刺激小鼠骨髓來源肥大細(xì)胞(mousebonemarrowderivedmastcells，mBMMCs)，觀察其對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺和分泌炎癥介質(zhì)活性的影響，并對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行初步探討，同時(shí)研究了瑞舒伐他汀干預(yù)對(duì)AGE-LDL作用的影響，為糖尿病致AS和急性心血管事件提供新理論。
　　 研究方法：首先分離6-8周齡雄性C57B

3、L/6小鼠骨髓細(xì)胞，以重組鼠白細(xì)胞介素-3(recombinantmurineInterleukin-3，rmIL-3)和重組鼠干細(xì)胞因子(recombinantmurineStemcellfactor，rmSCF)體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向肥大細(xì)胞分化，5周后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行細(xì)胞鑒定。接下來從兩個(gè)方面研究AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞活性的影響：(1)AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的影響：給予不同濃度的AGE-LDL刺激，用OP

4、T熒光法檢測肥大細(xì)胞釋放組胺水平；(2)AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的影響：Real-timePCR檢測不同濃度AGE-LDL作用6小時(shí)后肥大細(xì)胞腫瘤壞死因子a(Tumournecroticfactor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)和γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)mRNA表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)檢

5、測作用24小時(shí)后細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平。最后對(duì)AGE-LDL影響肥大細(xì)胞活性可能的信號(hào)通路進(jìn)行研究：(1)用AGE-LDL刺激肥大細(xì)胞，分別在0、0.25、0.5、1、2h時(shí)用Western印跡法分析核因子κB(Nuclear-κB，NF-κB)、p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化情況。(2)分別給予NF-κB、p38、ERK1/2抑制劑PDTC、SB203580、PD98059和瑞舒伐他汀，再用A

6、GE-LDL刺激肥大細(xì)胞，觀察細(xì)胞釋放組胺和分泌炎癥介質(zhì)的情況。(3)Western印跡法檢測PDTC、SB203580和PD98059對(duì)AGE-LDL作用下NF-κB磷酸化的影響。
　　 研究結(jié)果：(1)rmIL-3和rmSCF在體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)5周后，甲苯胺藍(lán)染色顯示超過95％的細(xì)胞被染成藍(lán)紫色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD117和FcεRIa表達(dá)雙陽性率為95.6％，鑒定為成熟的肥大細(xì)胞。(2)AGE-LDL對(duì)肥

7、大細(xì)胞活性的影響：AGE-LDL可刺激肥大細(xì)胞釋放組胺，在10分鐘作用最強(qiáng)，同時(shí)該作用呈濃度依賴性，與對(duì)照組和非糖化低密度脂蛋白.(n-LDL)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，在50ug/ml時(shí)達(dá)峰。不同濃度AGE-LDL刺激可顯著上調(diào)肥大細(xì)胞炎癥因子，諸如TNF-a、IL-6、IFN-γmRNA的表達(dá)，同時(shí)上清中相關(guān)因子的水平較對(duì)照組明顯上調(diào)，以50ug/ml作用最強(qiáng)(p<0.05)。(3)AGE-LDL影響肥大細(xì)胞活性的信

8、號(hào)通路研究：AGE-LDL能夠促進(jìn)p38MAPK、ERK1/2和NF-κB磷酸化，而對(duì)JNK磷酸化無影響；AGE-LDL作用15分鐘時(shí)NF-κB磷酸化、P38MAPK磷酸化均達(dá)峰值，作用30分鐘時(shí)ERK1/2磷酸化達(dá)峰值。瑞舒伐他汀能下調(diào)AGE-LDL作用下NF-κB、p38MAPK和ERK1/2磷酸化。P38MAPK、ERLK1/2抑制劑SB203580、PD98059均能下調(diào)AGE-LDL作用下NF-κB的磷酸化。PDTC、瑞舒他汀

9、能夠抑制AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞釋放組胺的影響。NF-κB抑制劑PDTC、ERK1/2抑制劑PD98059和瑞舒伐他汀能抑制AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)的作用。
　　 研究結(jié)論：AGE-LDL能夠激活肥大細(xì)胞，促進(jìn)其釋放組胺和分泌炎癥介質(zhì)TNF-a、IL-6、IFN-γ，該作用與ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路的激活相關(guān)。瑞舒伐他汀能夠抑制AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞的激活作用。AGE-LDL對(duì)肥大細(xì)胞活性的影響可能是糖尿病