晚期糖基化終產物修飾蛋白質誘導人胚胎肝細胞產生C反應蛋白及其作用機制研究.pdf

1、研究背景 心血管疾病(CardiovascularDiseases,CVD)是慢性腎臟疾病(ChronicKidneyDisease,CKD)患者死亡的主要原因。CKD患者動脈粥樣硬化的發(fā)生率較正?；驘o慢性腎臟疾病的人群高10～20倍，且發(fā)病年齡明顯提前，被稱之為“加速性動脈粥樣硬化”。C-反應蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)近10余年來的研究熱點。CKD時的微炎癥反應是較為復雜的病理生理過程，不僅有包括IL-

2、6在內的多種促炎癥細胞因子血癥，而且循環(huán)和組織中存在著各種因腎功能障礙而潴留的代謝產物或毒素，某些尿毒癥毒素已被證實具有較強的促炎癥活性，其中晚期糖基化終產物(AdvancedGlycationEndProducts,AGEs)修飾的蛋白質是近年研究較為透徹的與炎癥反應有關的一類新型尿毒癥毒素。 AGEs是糖的醛基和蛋白質的氨基之間非酶性糖化、氧化反應的終產物。我們課題組及國外學者的研究結果均表明，AGEs修飾蛋白具有顯著的促發(fā)

3、細胞炎癥反應的功能，并參與微炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展。且AGEs及其受體RAGE(ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts)軸的活化水平與CKD患者血循環(huán)中CRP水平存在密切的正相關關系。然而，目前還不清楚AGEs修飾蛋白能否直接刺激肝細胞生成CRP，抑或通過誘導單核細胞生成促炎癥細胞因子間接上調CRP的生成。 研究方法 我們以AGEs修飾的人血清白蛋白(AGEs-HSA)作為AGEs模

4、型，以體外培養(yǎng)的人胚胎肝細胞(HumanFetalHepatocytes,HFHs)作為靶細胞，研究了AGEs對人胚胎肝細胞CRP的誘導作用及其作用機制 一人胚胎肝細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定 選用臨床上正常孕婦自然流產廢棄的孕期為20w-24w的胚胎肝臟標本，應用改良的Seglen's肝臟CollagenaseⅣ兩步灌流法分離人胚胎肝細胞。用DiscontinuousPercollGradients密度梯度離心法將胚胎

5、肝細胞純化，用Ham'sF12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)純化的人胚胎肝細胞。 二ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)法檢測胚胎肝細胞上清中CRP的濃度 1、AGEs-HSA對人胚胎肝細胞合成CRP的影響 人胚胎肝細胞接種于48孔板，然后給予AGEs-HSA(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)作用48h，收集上清，用ELISA法檢測其

6、中的CRP水平。 2、AGEs-HSA處理的單核細胞條件上清對人胚胎肝細胞合成CRP的影響 通過對不同劑量的AGEs-HSA處理人單核細胞不同時間的條件上清按不同摻入比例加入胚胎肝細胞培養(yǎng)體系作用48h進行預實驗，初步的預實驗結果表明：100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細胞條件上清在80％的摻入比例作用胚胎肝細胞48h時達到最大的時間劑量效應。因此，我們選用100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細

7、胞條件上清占胚胎肝細胞培養(yǎng)體系80％的濃度(簡稱為：單核細胞條件上清)作為下一步實驗的刺激母液。同時，用100μg/mLHSA處理48h的單核細胞條件上清或單純RPMI1640處理48h的單核細胞條 3、細胞因子中和性抗體及其可溶性受體對單核細胞條件上清誘導人胚胎肝細胞合成CRP的影響 單核細胞條件上清母液分別與抗Interleukin(IL)-6(5μg/mL)、抗IL-1β(5μg/mL)、重組的人白介素1可溶性受體

8、Ⅰ(rhIL-1sRI)(10μg/mL)、抗TumorNerosisFactor(TNF)-α(10μg/mL)、重組的人腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅰ(rhTNF-sRI)(200ng/mL)，或上述不同中和性抗體的疊加組合{抗IL-6(5μg/mL)+抗IL-1β(5μg/mL)、抗IL-6(5μg/mL)+抗IL-1β(5μg/mL)+抗TNF-α(10μg/mL)}預先孵育1h，然后再加入胚胎肝細胞培養(yǎng)體系，作用48h，收集細胞上清

9、，用ELISA法檢測其中的CRP水平。 4、單核細胞條件上清與外源性細胞因子對人胚胎肝細胞CRP誘導作用的比較 通過預實驗結果表明：ELISA法檢測100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細胞上清中的IL-6、IL-1β和TNF-α濃度分別為：12.124±0.134ng/mL，3.972±0.077ng/mL和13.052±0.165ng/mL。因此，上述單核細胞條件上清母液中IL-6、IL-1β和TNF-α的

10、濃度分別為：9.70ng/mL、3.18ng/mL和10.44ng/mL。 三、實時熒光定量RT-PCR(RealTimeFluorescenceQuantitativeRT-PCR)檢測AGEs-HSA處理的單核細胞條件上清誘導人胚胎肝細胞CRPmRNA的表達水平 人胚胎肝細胞接種于60mm培養(yǎng)皿，分別給予上述單核細胞條件上清母液，1∶2、1∶4和1∶8倍比稀釋的單核細胞條件上清(用HamsF12條件培養(yǎng)基將上述單核細

11、胞條件上清作2倍，4倍和8倍稀釋而成)與人胚胎肝細胞共同培養(yǎng)48h。提取細胞總RNA，用SYBR(R)ExScripTMRT-PCRKit檢測其CRPmRNA水平。 結果 一、人胚胎肝細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定 1、運用改良法分離人胚胎肝細胞活力＞99％；純化后可見淡黃色的胚胎肝細胞主要分布在1.057g/ml和1.063g/ml兩個密度條帶；Ham'sF12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人胚胎肝細胞呈現(xiàn)典型的肝細胞特異性的

12、多角形形態(tài)。 2、所培養(yǎng)的細胞中無CD68陽性細胞。用兔抗人VWF檢測細胞培養(yǎng)體系中肝血竇內皮細胞特異性抗原VWF的表達，結果表明：所培養(yǎng)的細胞中無VWF陽性細胞。用鼠抗人Desmin檢測細胞培養(yǎng)體系中肝儲脂細胞特異性抗原Desmin的表達，結果表明：所培養(yǎng)的細胞中無Desmin染色陽性細胞。 3流式細胞術檢測離心純化后不同密度的Percoll條帶中肝實質細胞和肝Kuffer's細胞的比例，結果表明：胚胎肝實質細胞主要聚

13、集在1.057g/mL和1.063g/mL兩個密度條帶，其中的胚胎肝實質細胞比例分別為72.70±0.63％，77.60±3.34％，而肝Kuffer's細胞主要聚集在1.052g/mL密度條帶，含量為12.92±1.13％。 二、AGEs-HSA對人胚胎肝細胞產生CRP的誘導作用 結果表明：不同劑量的AGEs-HSA處理組之間以及與陰性對照組之間相比無顯著性差異(P＞0.05)。 三、單核細胞條件上清對人胚胎肝

14、細胞產生CRP的誘導作用 1、單核細胞條件上清以時間依賴的方式誘導人胚胎肝細胞合成CRP。48h時達到最大時間效應，與12h及24h相比有顯著性差異(P＜0.001)。 2、1∶2倍比稀釋的單核細胞條件上清與胚胎肝細胞孵育48h即可顯著誘導胚胎肝細胞產生CRP，與陰性對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，且單核細胞條件上清以劑量依賴的方式誘導人胚胎肝細胞產生CRP。 四、細胞因子中和性抗體及其可溶性受體對單核細

15、胞條件上清誘導人胚胎肝細胞產生CRP的中和作用表明：抗IL-6、抗IL-1β及IL-1sRI均可部分抑制單核細胞條件上清對人胚胎肝細胞CRP合成的誘導作用，與未加細胞因子中和性抗體的單核細胞條件上清處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)；抗IL-6能夠更顯著地抑制單核細胞條件上清對人胚胎肝細胞CRP合成的誘導作用，與抗IL-1β及IL-1sRI處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)；抗IL-1β及IL-1sRI可以同等程度地抑制單核細胞

16、條件上清對人胚胎肝細胞CRP合成的誘導作用，二者相比無顯著性差異(P＞0.05)。 五、單核細胞條件上清與外源性細胞因子對人胚胎肝細胞CRP誘導作用的比較對外源性細胞因子的研究結果表明：3.18ng/mLIL-1β和9.7ng/mLIL-6處理組均可顯著誘導人胚胎肝細胞產生CRP，與陰性對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，但二者對CRP的誘導作用均明顯低于單核細胞條件上清對CRP的誘導作用(P＜0.05)。 所有細胞因

17、子組合均可顯著誘導人胚胎肝細胞產生CRP，與陰性對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 六、1∶2倍比稀釋的單核細胞條件上清即可顯著誘導CRPmRNA表達，與陰性對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。單核細胞條件上清呈現(xiàn)以劑量依賴方式誘導人胚胎肝細胞CRPmRNA的表達，在與單核細胞條件上清母液作用時達到最大劑量效應，與1∶2倍比稀釋的單核細胞條件上清處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 結論 1應用我們