人朊蛋白N-糖基化修飾對(duì)體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的初步研究.pdf

1、朊病毒病(Priondisease)是一組累及人和動(dòng)物的傳染性神經(jīng)退行性疾病。其致病因子是一種無(wú)核酸的傳染性蛋白顆粒。 本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，朊蛋白糖基化比率與細(xì)胞生物學(xué)功能之間存在一定的聯(lián)系。本研究通過(guò)對(duì)PrP進(jìn)行糖基化修飾，來(lái)研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。首先從健康人外周血白細(xì)胞總DNA中克隆得到人朊蛋白基因PRNP，并通過(guò)定點(diǎn)突變的方法獲得兩種糖基化單位點(diǎn)突變的PRNPN181Q、PRNPN197Q(分別突變第一個(gè)和第二個(gè)

2、糖基化位點(diǎn))和一種去N-糖基化突變的PRNPN181Q/N197Q朊蛋白基因(同時(shí)突變兩個(gè)糖基化位點(diǎn))。將上述質(zhì)粒導(dǎo)入SF126和HeLa細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，Westernblot檢測(cè)證實(shí)，表達(dá)的野生型PrP蛋白呈現(xiàn)多糖基化修飾帶型，分子量范圍30-35kDa。經(jīng)糖苷酶PNGaseF消化后，電泳條帶下移。兩種N-糖基化單點(diǎn)修飾PrP表達(dá)不完全的糖基化形式，分子量在29-30kDa;而去N-糖基化修飾PrP不具有N-糖基化的形式，

3、分子量約27kDa。糖基化修飾的PrP均能夠被糖苷酶消化，分子條帶下移。表明成功表達(dá)野生型PrP和所設(shè)計(jì)的單糖基化和去N-糖基化修飾。 利用Hoechst33342/PI細(xì)胞核染色、MTT法分析細(xì)胞增殖、AnnexinV/PI雙染檢測(cè)PS外翻和PI單染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等經(jīng)典細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，證明在體外實(shí)驗(yàn)條件下，在SF126和HeLa細(xì)胞中表達(dá)重組朊蛋白，與野生型PrP比較，去N-糖基化修飾PrP易于引發(fā)更為明顯的凋亡現(xiàn)象，N-糖

4、基化單點(diǎn)修飾PrP的致凋亡作用較輕微，與野生型接近。進(jìn)一步證明發(fā)生細(xì)胞凋亡的機(jī)制，分析了細(xì)胞內(nèi)活性氧，發(fā)現(xiàn)與野生型PrP比較，去N-糖基化修飾PrP更容易引發(fā)HeLa細(xì)胞中活性氧的堆積，在轉(zhuǎn)染12h達(dá)到高峰，說(shuō)明ROS在細(xì)胞早期凋亡中發(fā)揮著重要的作用。線粒體與活性氧有著密切的關(guān)系，進(jìn)一步分析了線粒體的變化。N-糖基化PrP引發(fā)的細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降。Westernblot分析線粒體相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞Bcl-xL蛋白表達(dá)水平明顯下