鴨圓環(huán)病毒Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒增殖與致病性的影響.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)是圓環(huán)病毒科的成員之一，主要侵害鴨免疫系統(tǒng)使其發(fā)生免疫抑制，其基因組由多個(gè)ORF組成，其中ORF1主要編碼Rep蛋白（Replication protein，復(fù)制蛋白），該蛋白與病毒復(fù)制有關(guān)。而糖基化在蛋白翻譯后有重要的修飾和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用。本研究通過(guò)DuCV Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)的突變來(lái)探究Rep蛋白對(duì)病毒增殖與致病性的影響。
　　1.DuCV Rep蛋白N-糖基化

2、位點(diǎn)突變株的構(gòu)建
　　以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的雙拷貝克隆株（已引入與病毒復(fù)制調(diào)控區(qū)域無(wú)關(guān)的酶切位點(diǎn)XhoⅠ）為模板，利用重疊PCR的方法針對(duì)Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)（即Rep蛋白第6位與第18位氨基酸）進(jìn)行突變，獲得的突變株W-6(Rep蛋白第6位氨基酸突變株)和W-18(Rep蛋白第18位氨基酸突變株)并通過(guò)免疫雛鴨來(lái)檢驗(yàn)拯救效果。結(jié)果顯示:在接種后第1d、2d未在血清中擴(kuò)增出DuCV目的片段，但第4d在雛鴨血清中檢出DuCV目的片段

3、，表明擴(kuò)增產(chǎn)物不是直接來(lái)源于動(dòng)物接種的突變DNA，后經(jīng)測(cè)序確認(rèn)在血清中所抽提的DNA含有改造的XhoⅠ酶切位點(diǎn)，顯示所構(gòu)建的該病毒突變株已在鴨體內(nèi)成功環(huán)化并增殖。
　　2.DuCV Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒增殖的影響
　　將突變株W-6（試驗(yàn)組Ⅰ）、W-18（試驗(yàn)組Ⅱ）和感染性克隆株pIC-2DuCV（陽(yáng)性對(duì)照組）與PBS（陰性對(duì)照組）分別對(duì)隨機(jī)分為4組的3周齡雛鴨進(jìn)行人工感染，在第7d、14d、21d、28d、35d

4、、42d時(shí)采集胸腺、脾臟、法氏囊等組織進(jìn)行熒光定量PCR和免疫組化檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Ⅰ病毒DNA含量在被檢組織中以肝臟含量相對(duì)較多，其拷貝數(shù)最高為104.9 copies/mg，在法氏囊中病毒DNA含量最低，其拷貝數(shù)最高為103.2copies/mg;而試驗(yàn)組Ⅱ與陽(yáng)性對(duì)照組相比DNA含量相近，被檢組織中DNA含量相對(duì)較多的組織為肝臟，其拷貝數(shù)分別最高為106.3 copies/mg(試

5、驗(yàn)組Ⅱ)和107.0 copies/mg（陽(yáng)性對(duì)照組），而含量較低的組織則為法氏囊，其拷貝數(shù)最高值分別為1042copies/mg（試驗(yàn)組Ⅱ）和104.5copies/mg（陽(yáng)性對(duì)照組）。免疫組化結(jié)果顯示，在被感染后，試驗(yàn)組Ⅰ各個(gè)組織中的陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度(Theaverage optical density, AOD)值中肝臟和法氏囊中陽(yáng)性細(xì)胞的AOD值相對(duì)高一些，最高值在0.1774±0.00076到0.1679±0.01469之間

6、;試驗(yàn)組Ⅱ中，陽(yáng)性細(xì)胞AOD值最高的組織是肝臟和法氏囊，其最高值在0.2697±0.05571到0.2339±0.02187間，經(jīng)差異性分析可知其AOD值與對(duì)照組相無(wú)明顯差異。由此表明，DuCV Rep蛋白第6位氨基酸突變后可以使病毒在動(dòng)物體內(nèi)的增殖效率降低，而DuCV Rep蛋白第18位氨基酸突變后對(duì)病毒增殖則無(wú)明顯影響，為DuCV的增殖進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。
　　3.DuCV Rep蛋白N-糖基化位點(diǎn)對(duì)該病毒致病性的影響<

7、br>　　將突變株W-6（試驗(yàn)組Ⅰ）、W-18(試驗(yàn)組Ⅱ)和感染性克隆株pIC-2DuCV（陽(yáng)性對(duì)照組）與PBS陰性對(duì)照組分別對(duì)3周齡雛鴨進(jìn)行人工感染，在第7d、14d、21d、28d、35d、42d時(shí)采集胸腺、脾臟等組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示:試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ與陽(yáng)性對(duì)照組均出現(xiàn)胸腺出現(xiàn)散在出血點(diǎn)，肝臟有少量出血點(diǎn)，各組的組織病變均不明顯。經(jīng)HE染色可知各試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的主要免疫器官如胸腺、脾臟等均出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，主要表