豬圓環(huán)病毒2型與豬鼻支原體共感染協(xié)同致病性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcinecircovirus-associated disease，PCVAD)的重要病原，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)能夠感染不同年齡的豬，引起胸膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、多發(fā)性漿膜炎及豬地方性肺炎(Swine enzootic pneumoniae，SEP)，嚴(yán)重影

2、響豬只生長(zhǎng)性能。該病原體在臨床上常與PCV2、PRRSV等病原體混合感染，致使斷奶仔豬的死亡率顯著升高。目前Mhr和PCV2的共感染特性及其感染機(jī)制尚不清楚，闡明這兩種病原體協(xié)同感染對(duì)仔豬的致病性具有重要的臨床意義。本研究通過(guò)建立Mhr核酸、抗原和抗體等的檢測(cè)方法，利用實(shí)驗(yàn)室分離的Mhr（DL株）與PCV2(PCV2b，YJ株)進(jìn)行了共感染試驗(yàn)，旨在闡明這兩種病原體共感染對(duì)仔豬的致病性作用。
　　第一、豬鼻支原體抗體間接ELISA

3、檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用。為了檢測(cè)豬血清中Mhr抗體水平，本研究采用脫氧膽酸鈉法(DOC)提取Mhr膜蛋白作為包被抗原，建立了用于Mhr血清抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。其特異性為90.5％，敏感性為98.0％。除豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo）外，該方法與幾種豬病毒陽(yáng)性血清及副豬嗜血桿菌Ⅳ型陽(yáng)性參考血清均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)Mhr-DL菌株感染巴馬豬血清抗體檢測(cè)表明，Mhr感染后第3d血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，第35

4、 d時(shí)抗體達(dá)到高峰，抗體效價(jià)為1∶6400。用該方法與IDEXX肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)138份現(xiàn)地血清樣品，Mhr和Mhp陽(yáng)性檢出率分別為71.0％和44.9％。對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、山東等地臨床送檢的457份血清檢測(cè)結(jié)果顯示，Mhr陽(yáng)性率為70.3％，表明我國(guó)養(yǎng)豬群Mhr感染十分普遍。
　　第二、抗Mhr膜蛋白的單克隆抗體制備及抗原表位的鑒定。本研究以DOC提取的Mhr膜蛋白免疫BALB/c小鼠，并通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)

5、獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌特異性抗DOC提取膜蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為1B4、1D2、1H8、1H12、2B6、2H2、3G2、3G10、4B7和4H2; MAb亞類(lèi)鑒定除2H2為IgG2b亞型外均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈;雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)為1∶200～1∶400，腹水效價(jià)為1∶1.0×105～1∶2.0×105;Western blot結(jié)果顯示，其中5株單克隆抗體針對(duì)Mhr同一種大小膜蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。經(jīng)質(zhì)譜分析、蛋

6、白表達(dá)和Western blot鑒定該膜蛋白為Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基。為了對(duì)其抗原表位進(jìn)行鑒定，通過(guò)對(duì)Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基截短表達(dá)與人工合成肽相結(jié)合的方法對(duì)其表位進(jìn)一步分析，初步確定了3個(gè)抗原表位，分別為269S SDNPRIYRTEEEEK283，299KDKKYITDEEIKQIW313和350LKEQKQHAKDY360。
　　第三、Mhr核酸檢測(cè)SYBR熒光定量PCR方法的建立及其應(yīng)用。為了檢測(cè)豬

7、血液及組織中Mhr核酸載量，本研究參考GenBank發(fā)表的Mhr P37基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了一種能夠檢測(cè)Mhr核酸載量的特異性好、敏感性高的SYBR熒光定量PCR方法。該方法擴(kuò)增效率為1.04，誤差值為0.0189，批內(nèi)變異系數(shù)小于2.0％。與常規(guī)PCR相比，本方法敏感性提高100倍以上。該方法與豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、PCV2、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和M

8、hyo均無(wú)交叉反應(yīng)。利用本試驗(yàn)方法對(duì)Mhr-DL菌株經(jīng)氣管、腹腔和氣管+腹腔感染仔豬21d后剖殺的各組織中Mhr核酸含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Mhr核酸主要存在于扁桃體和肺臟中，且腹腔和氣管+腹腔感染組試驗(yàn)豬Mhr核酸載量明顯高于氣管感染組和對(duì)照組。
　　第四、PCV2和Mhr共感染試驗(yàn)仔豬的協(xié)同致病性試驗(yàn)。為了闡明PCV2和Mhr的協(xié)同致病作用及這兩種病原體不同時(shí)間順序共感染與其協(xié)同致病性之間的關(guān)系，試驗(yàn)選用30日齡健康仔豬30頭，隨機(jī)

9、分為6組（每組5頭），分別為Mhr-PCV2共感染組、Mhr/PCV2順序共感染組（感染Mhr1w后感染PCV2）、PCV2/Mhr順序共感染組(感染PCV21 w后感染Mhr)、Mhr單感染組、PCV2單感染組及對(duì)照組。臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，感染后Mhr-PCV2、PCV2/Mhr、Mhr/PCV2共感染組和Mhr單感染組均能觀察到短暫的食欲不振、體溫升高、咳嗽、跛行和體重降低。血清抗體檢測(cè)結(jié)果表明，Mhr-PCV2、PCV2/Mhr和M