豬圓環(huán)病毒2型感染分子診斷與防制的相關(guān)研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒感染是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的一種新傳染病，母豬表現(xiàn)為繁殖障礙，仔豬和斷奶豬主要特征為豬體質(zhì)下降，消瘦，呼吸困難，咳喘，腹瀉和黃疸等。PCV2與多種豬病相關(guān)，主要引起仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙、豬呼吸道綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎、滲出性皮炎和仔豬先天性震顫等。尤其PMWS，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼

2、白及黃疸等，病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明，該病在包括我國在內(nèi)的許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本論文主要是對PCV2感染的分子診斷方法、PCV2基因工程疫苗以及不同硒源對PCV2體外復(fù)制的影響與機理進行了研究，其目的是為PCV2感染的診斷與防制提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)。主要內(nèi)容如下： 試驗1.豬圓環(huán)病毒2型、細小病毒及偽狂犬病毒多重PCR方法的建立 豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬

3、病(PRV)是引起母豬繁殖障礙的重要致病因素。為了解臨床上這三種疾病的混合感染并進行鑒別診斷，本文建立了一種同時檢測PCV2、PPV、及PRV疫苗株與野毒株的多重PCR方法。根據(jù)GenBank上發(fā)表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列，針對各自保守區(qū)各設(shè)計一對特異性引物，用這四對引物對同一樣品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE進行檢測，結(jié)果可同時擴增出269 bp(PCV2)、581 bp(PPV)、372 bP(PRV

4、 gB)及147 bp(PRV gE)四條特異性片段。對JEV、PRRSRV、大腸桿菌和雙蒸水的PCR擴增結(jié)果均為陰性；敏感性測定結(jié)果表明，該多重PCR能檢出PCV2 10 ng、PPV和PRV gB、gE分別為10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板。 試驗2.豬圓環(huán)病毒2型實時定量PCR檢測方法的建立 利用PCR技術(shù)擴增PCV2 ORF2保守區(qū)基因107 bp片段并克隆到pMD-19-T載體上，純化

5、的質(zhì)粒作為PCR檢測的標準樣品，以10倍梯度稀釋的標準樣品為模板，進行熒光定量PCR，并繪制標準曲線。建立的實時定量PCR方法，起始模板濃度與Ct值之間呈很好的線性關(guān)系，標準曲線斜率為-0.32，相關(guān)系數(shù)r2=0.997，Ct值在11.9和26.9之間。PCV2能擴出S型熒光曲線，熔解曲線的峰狹窄單一，而PCV1、PPV和PRV均不能擴出。對32份健康豬和32份PMWS可疑豬樣品定量檢測：健康豬陽性率為44％ (14/32)，病毒載量均

6、小于104拷貝·μL-1；PMWS可疑豬陽性率96.8％(31/32)，病毒載量均大于105拷貝·μL-1。 試驗3.豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因表達及重組蛋白ELISA方法的建立 根據(jù)GenBank中豬群圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2基因序列設(shè)計特異性引物，回收PCR產(chǎn)物，將其克隆入pMD18-T載體，再定向克隆到表達載體pET-32a中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，進行原核表達。表達產(chǎn)物經(jīng)His-Bind蛋白純化試劑

7、盒純化，平均濃度為1.10 mgml/L。以1.8 mgml/L蛋白包被酶標板，建立ELISA檢測方法。建立的ELISA方法，與北京世紀元亨公司試劑盒比較，符合率達85％以上。用該方法對常州某豬場36份母豬和156份10-160日齡豬群血清抗體進行了檢測，檢測結(jié)果顯示母豬抗體陽性率為81.4％，仔豬抗體陽性率隨著日齡的增加，陽性率逐漸降低，后由于受PCV2的感染，陽性率逐漸升高。本文建立的ELISA方法，具有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性

8、，可用于豬群PCV2抗體的大規(guī)模檢測。 試驗4.重組圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因的豬細小病毒VP2病毒樣粒子的構(gòu)建與鑒定 利用PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原轉(zhuǎn)運載體，將豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽嵌合在豬細小病毒(PPV) VP2N端，然后重組到腺病毒pAdEasy-1表達系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，獲得重組腺病毒(rAd-△Cap-△VP2)。通過空斑純化，測定其TCID50為

9、1011.5ml/L。IFA和Western-blotting分析分別可見特異性熒光和大小約為64 kDa的特異性帶，表明rAd-△Cp-△VP2在HEK-293細胞中成功地表達了PPV:△VP2和PCV2:△Cap蛋白。紅細胞凝集試驗證實，表達的嵌合蛋白具有與全病毒類似的血凝活性。電鏡觀察嵌合蛋白的粗提物，發(fā)現(xiàn)可自行裝配成病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]。 試驗5.共表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白及白細胞介素-2的重組腺

10、病毒的構(gòu)建與鑒定 本研究利用PCR技術(shù)將PCV2 Cap蛋白基因和IL-2-Cap融合基因分別克隆入人5型腺病毒穿梭載體(pShuttle-CMV)，與腺病毒骨架載體(pAdEasyTM)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進行同源重組并轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞，經(jīng)多次亞克隆獲得了重組腺病毒rAd-Cap和rAd-IL-2-Cap。測定其TCID50為1010.6ml/L，10102ml/L。利用RT-PCR、IFA、間接ELISA、We

11、stern-blotting等方法以及IL-2 ELISA試劑盒分別檢測豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和IL-2的體外表達情況，結(jié)果證實兩基因在腺病毒中獲得了表達。該研究為研制PCV2基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。 試驗6.重組腺病毒免疫特性的研究 本研究通過小鼠試驗分別觀察了重組腺病毒rAd-△Cap-△VP2，rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2的免疫特性。取120只6-8周齡的清潔級ICR小鼠，隨機分為四組，每組30只，第

12、1組每只小鼠皮下注射1010TCID50重組腺病毒rAd-△Cap-△VP2；第2組每只小鼠皮下注射1010TCID50重組腺病毒rAd-Cap，第3組每只小鼠皮下注射1010TCID50 rAd-Cap-IL-2，第4組每只小鼠皮下注射1010TCID50空的腺病毒(wild Ad)，兩周后按相同方法加強免疫1次，隔離飼養(yǎng)，并分別在首免后0，14，28，35，42，49和56天，每組取4只小鼠宰殺，采集血清，測定PCV2特異性ELIS

13、A抗體和中和抗體；同時無菌取其脾臟，進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。結(jié)果為前3組免疫小鼠在二免后14天都能檢測到PCV2 ELISA杭體，抗體水平隨著時間逐漸升高，在二免后35天時ELISA杭體水平達最高分別為1:10000，1:6000和1:9600，PCV2中和抗體平均滴度分別為1:16，1:10和1:12:同時，第1組免疫小鼠血清中PPV中和抗體達1:20。第4組免疫小鼠在免疫后均未檢測到ELISA杭體和中和抗體。Western blott

14、ing試驗結(jié)果表明，免疫小鼠血清中存在PCV2特異性杭體。淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果為首免后42和56天前3組小鼠Con A/LPS刺激指數(shù)不同程度升高。上述結(jié)果表明，重組腺病rAd-△Cap-△VP2，rAd-Cap和rAd-Cap-IL-2可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，rAd-△Cap-△VP2免疫效果更顯著。 試驗7.不同硒源對豬圓環(huán)病毒2型體外感染的影響 本試驗在已建立的PCV2型實時定量PCR方法檢測