豬圓環(huán)病毒2型人工感染和重組腺病毒基因工程疫苗研究.pdf

1、本研究在臨床征狀和病理學(xué)觀察的基礎(chǔ)上用PCR方法，對2002年1月-2002年12月江蘇、上海、山東、江西、安徽和浙江等省市的100家豬場146例患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的豬肺臟和淋巴結(jié)，進(jìn)行了PCV2和PRRSV基因檢測，發(fā)現(xiàn)24家豬場28例病料為PCV2陽性，64家豬場77例病料為PRRSV陽性，其中19家豬場21例病料同時(shí)感染了PCV2和PRRSV。從送檢的病料中分離到兩株P(guān)CV2，即PCV2-SH和PCV2-AH

2、。經(jīng)PCR擴(kuò)增部分ORF2基因和序列分析，結(jié)果顯示，兩個(gè)分離株部分ORF2與國外分離毒株同源性為92％-99％，兩個(gè)分離株部分ORF2基因存在一定差異。表明我國PMWS患病豬群廣泛存在PCV2感染，而且大部分同時(shí)感染了PRRSV；不同地區(qū)PCV2存在一定基因差異，它們可能來源于不同國家或地區(qū)。 將24頭斷奶仔豬(32日齡)隨機(jī)分為6組即PCV2攻毒后KIH刺激組、PCV2+PRRSV混合感染組、PCV2攻毒組、PRRSV攻毒組、

3、鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)刺激組和對照組。每組4頭，進(jìn)行PCV2攻毒試驗(yàn)。攻毒后隔離飼養(yǎng)，觀察臨床征狀并對瀕死豬進(jìn)行病理解剖。攻毒后不同時(shí)間采血或組織臟器，用PCR和RT-PCR檢測病毒。結(jié)果為空白對照組和KIH刺激組未出現(xiàn)臨床征狀，PCV2和PRRSV攻毒組僅表現(xiàn)短暫的體溫升高，而PCV2攻毒KLH刺激組和PCV2+PRRSV混合感染組出現(xiàn)明顯的臨床征狀，其中PCV2攻毒后KLH刺激組的2頭豬在攻毒后11天瀕臨死亡，宰殺后臟器出現(xiàn)明顯的

4、病理變化，各攻毒豬于攻毒后四天出現(xiàn)病毒血征，宰殺后肺臟、淋巴結(jié)均檢測到PCV2和PRRSV。以上結(jié)果說明PCV2是引起PMWS的主要病原，KIH是PMWS的重要誘因。PCV2和PRRSV混合感染可引起PMWS。本研究成功復(fù)制了PMWS，為該病免疫預(yù)防研究奠定了重要基礎(chǔ)。 PCV2是近年來新發(fā)現(xiàn)的引起仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的必需病原，含 博士學(xué)位論文：豬圓環(huán)病毒2型感染和重組腺病毒基因工程疫苗的研究有兩個(gè)主要的閱

5、讀框ORF1和ORF2，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep蛋白)和核衣殼蛋白(cap蛋白)，其中Cap蛋白含有病毒主要抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候選目的基因。本研究利用PCR技術(shù)將Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭載體(pShuttle-CMV)，并與腺病毒骨架載體(pAdEasy-1)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組并轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，經(jīng)3次亞克隆獲得了重組腺病毒rAd-Cap，測定其TCID<,50>為10<

6、'13.0>／mL。用RT-PCR、間接ELISA、Western blot和IPMA等試驗(yàn)證明了Cap蛋白在該重組腺病毒感染的293A細(xì)胞中獲得表達(dá)。為了進(jìn)一步研究重組病毒rAd-Cap的免疫特性，分別進(jìn)行了小鼠和豬體試驗(yàn)。取100只6-8周齡的清潔級小鼠，隨機(jī)分為五組，每組20只，第1、2和3組每只小鼠分別皮下注射10<'8>、10<'10>和10<'12>TCID<,50>重組腺病毒rAd-Cap，第4組每只小鼠皮下注射10<'8

7、> TCID<,50>空的腺病毒(wild Ad)，第5組每只皮下注射0.3mL滅菌PBS，兩周后按相同方法加強(qiáng)免疫1次，隔離飼養(yǎng)，并分別在二免后10、20、30和40天，每組取5只小鼠宰殺，采集血清，測定抗體和中和抗體；同時(shí)無菌取其脾臟，進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果為各組免疫小鼠在二免時(shí)能檢測到ELISA抗體，中和抗體滴度均<1:4，二免后40天時(shí)，10<'8>，10<'10>和10<'12>TCID<,50>組的ELISA抗體平均滴度

8、分別為1:2200，1:4800和1:6400，中和抗體平均滴度分別為1:8，1:14和1:17。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫小鼠血清中存在PCV2特異性抗體。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果為二免后30和40天各組小鼠刺激指數(shù)均升高。為了進(jìn)一步研究重組病毒對豬體的免疫特性，取9頭(同窩)32日齡PCV2陰性普通斷奶仔豬，隨機(jī)分為3組，每組3頭，第一組為免疫攻毒組；第二組為非免疫攻毒組；第三組為空白對照組。免疫組每頭豬皮下注射3.5×

9、10<'10>TCID<,50>重組病毒，首免后第17天加強(qiáng)免疫1次。首免后10、17、27和37天分別采血，測定ELISA抗體和中和抗體。除空白對照組外，其余豬在第37天攻毒PCV2，攻毒后4、7和11、19天用鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和巰基乙酸培養(yǎng)基進(jìn)行免疫刺激，隔離飼養(yǎng)觀察，32天后全部宰殺。結(jié)果為免疫豬在首免后10天即出現(xiàn)抗體，第27天中和抗體滴度為1:35，第37天ELISA抗體可達(dá)1:6400，中和抗體滴度為1:48。攻毒后

10、，免疫豬無明顯臨床征狀，增重與空白對照比較沒有顯著差異，免疫攻毒組仔豬病毒血征持續(xù)25天以內(nèi)，而非免疫攻毒組有明顯的異常臨床表現(xiàn)，增重緩慢，體溫升高，病毒血征持續(xù)32天以上。上述結(jié)果表明，該重組腺病毒rAd-Cap可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，可以作為PCV2基因工程疫苗的候選毒株，從而為有效預(yù)防該病奠定了基礎(chǔ)。 臨床上PCV2與PRRSV混合感染引起的PMWS較常見，死亡率和發(fā)病率

11、很高，但目前尚無能有效預(yù)防該病的商品化疫苗。本研究將PCV2 Cap蛋白基因克隆入已經(jīng)含有PRRSV GP5蛋白基因的穿梭載體rShuttle-ORF5中，然后與骨架載體pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，挑選陽性重組質(zhì)粒rAd-ORF2-ORF5，線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，多次純化獲得重組腺病毒rAd-Cap-GP5。經(jīng)IPMA、IFA和Western blot證明重組病毒同時(shí)表達(dá)了Cap蛋白和GP5蛋白

12、。分別通過小鼠和豬體試驗(yàn)進(jìn)一步研究了表達(dá)PCV2 Cap蛋白和PRRSV-GP5融合蛋白重組腺病毒免疫特性。(1)小鼠免疫試驗(yàn)：取40只6～8周齡的清潔級雄性小鼠，隨機(jī)分為2組，每組20只。第一組背部皮下多點(diǎn)注射2.5×10<'9.0>TCID<,50>重組腺病毒rAd-Cap-GP5，第二組每只小鼠皮下注射10<'8>TCID<,50>空的腺病毒作為陰性對照。首免后2周用相同的方法加強(qiáng)免疫1次，隔離飼養(yǎng)，并分別在一免后2、4、6和8周

13、，采集血清測定PCV2和PRRSV的ELISA抗體和中和抗體。二免后35天，每組取五只小鼠宰殺，取其脾臟，分離淋巴細(xì)胞，測定IFN-γ。結(jié)果為首免后2周免疫組即出現(xiàn)抗體，N二免后2周PCV2和PRRSV ELISA抗體水平分別為l：2400和1：3800，PCV2和PRRSV特異性中和抗體效價(jià)為1：14和1：4，二免后4周和6周PCV2中和抗體基本保持不變，而PRRSV中和抗體水平分別上升至1：10和1：12。二免后35天，免疫小鼠的I

14、FN-γ表達(dá)水平明顯高于對照組小鼠。(2)豬體免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)：取15頭32日齡PCV2和PRRSV陰性斷奶仔豬，隨機(jī)分為5組，每組3頭。第一組為免疫攻毒PCV2組；第二組為免疫攻毒PRRSV組；第三組為非免疫攻毒PCV2組；第四組為非免疫攻毒PRRSV組；第五組空白對照組。免疫組每頭豬皮下注射5×10<'10>TCID<,50>重組腺病毒，第17天重復(fù)免疫1次，隔離飼養(yǎng)觀察。首免后10、17、27和37天分別采血，測定ELISA抗體和

15、中和抗體。第37天進(jìn)行攻毒，免疫和非免疫PCV2攻毒組每頭豬滴鼻5×10<'5>TCID<,50>的PCV2-SH，免疫和非免疫PRRSV攻毒組每頭豬滴鼻3.5×10<'55>TCID<,50>的PRRSV。在攻毒后第4、7和11、19天PCV2攻毒組用鑰匙孔血藍(lán)蛋白和巰基乙酸培養(yǎng)基進(jìn)行免疫刺激。在攻毒前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量各頭豬的體重，攻毒后測定豬體溫，并于攻毒后第4、11、18、25和32天采集血清，測定PCV2和PRRSV病毒血征持續(xù)

16、時(shí)間。結(jié)果為：一免后第10天即可出現(xiàn)PCV2和PRRSV特異性ELISA抗體，第37天ELISA抗體效價(jià)分別達(dá)到1：6400和l：13400，中和抗體分別達(dá)到1：52和1：45。免疫豬無明顯臨床異常表現(xiàn)，與非免疫攻毒組比較增重快，與空白對照組相似，而非免疫攻毒豬有明顯臨床表現(xiàn)，增重緩慢。非免疫組攻毒組在攻毒后的整個(gè)過程可以檢測到PCV2和PRRSV，而免疫組在攻毒后25天病毒血征已全部消失。上述結(jié)果表明，重組腺病毒rAd-Cap-GP5

17、可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并可誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，可以作為預(yù)防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候選毒株。 通過本研究結(jié)果表明，在我國華東地區(qū)存在PMWS，分離株P(guān)CV2-SH對豬具有致病性，能引起斷奶仔豬發(fā)生PMWS。根據(jù)PCV2和PRRSV基因的免疫特性，們成功構(gòu)建了重組病毒rAd-Cap和rAd-Cap-GP5。免疫動物后結(jié)果表明，這兩株重組病毒可以誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對豬有一定的保護(hù)力。因