豬圓環(huán)病毒2型和豬細(xì)小病毒體外混合感染致病機(jī)制的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcinecircovirus associated disease，PCVAD)的主要病原，是重要的免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型單獨(dú)感染并不能引起典型的臨床癥狀，當(dāng)與其它病原體混合感染時(shí)能促進(jìn)疾病的發(fā)生。豬圓環(huán)病毒2型與豬細(xì)小病毒有共同的靶細(xì)胞，其混合感染的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，鑒于豬圓環(huán)病毒2型與

2、豬細(xì)小病毒混合感染是模擬斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的典型發(fā)病模型。本研究擬通過(guò)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型與豬細(xì)小病毒缽?fù)饣旌细腥静煌?xì)胞細(xì)胞因子水平變化，對(duì)其混合感染的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　1.PCV2，PPV, IFN-γ，TNF-α，IL-10，β-actin real-time PCR檢測(cè)方法的建立
　　本研究根據(jù)GenBank中

3、PCV2，PPV,豬IFN-γ，豬TNF-α，豬IL-10，β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR擴(kuò)增豬肺泡巨噬細(xì)胞中相應(yīng)的目的基因片段，連接到pMD18-T載體中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證基因序列的正確性。再根據(jù)GenBank中相應(yīng)序列設(shè)計(jì)PCV2，PPV,豬IFN-γ，豬豬TNF-Ⅱ，豬IL-10，豬β-actin real-time PCR擴(kuò)增引物，以上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化real-time PCR反應(yīng)體系及引物濃度，建立檢測(cè)P

4、CV2，PPV,豬IFN-γ,豬TNF-α，豬IL-10，豬β-actin基因的定量方法，并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，以優(yōu)化條件后real-time PCR反應(yīng)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)均符合要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線的判定系數(shù)R2均大于0.98，模板濃度在103-108 copies/μL具有良好的擴(kuò)增反應(yīng)，重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性良好。
　　2.PCV2與PPV混合感染對(duì)原代PAM的影響
　　本研究通過(guò)PCV2和PPV混合感染PAM后，

5、檢測(cè)感染后不同時(shí)間PCV2和PPV病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α，IL-10 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，分析PCV2和PPV混合感染對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。將PAM分為4組:PPV單獨(dú)感染組、PCV2單獨(dú)感染組、PCV2與PPV混合感染組、對(duì)照組。在接種病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各時(shí)間點(diǎn)提取病毒DNA及PAM細(xì)胞總RNA。用已經(jīng)建立的real-time PCR法檢測(cè)各組中病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α

6、，IL-10 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2與PPV混合感染組PCV2病毒核酸拷貝數(shù)高于PCV2單獨(dú)感染組，PCV2與PPV混合感染組PPV病毒核酸拷貝數(shù)在60hpi后顯著高于PPV單獨(dú)感染組;PCV2單獨(dú)感染組和PPV單獨(dú)感染組IFN-γmRNA表達(dá)水平上調(diào)，PCV2與PPV單獨(dú)感染組IFN-γmRNA表達(dá)表達(dá)水平下調(diào);病毒感染后都可引起TNF-αmRNA表達(dá)水平的上調(diào)，36hpi前PCV2感染

7、起主要作用，48hpi后PPV感染起主要作用，PCV2與PPV混合感染TNF-αmRNA明顯高于單獨(dú)感染姐;在24hpi、36hpi，PCV2和PPV單獨(dú)感染可引起IL-10 mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，PCV2與PPV混合感染后在36hpi、48hpi、IL-10mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，其它時(shí)間不顯著。
　　3.PCV2與PPV混合感染對(duì)3D4/21細(xì)胞的影響
　　本研究通過(guò)PCV2和PPV混合感染3D4/21細(xì)胞后，檢測(cè)感

8、染后不同時(shí)間PCV2和PPV病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，TNF-α，IL-10mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，分析PCV2和PPV混合感染對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。將3D4/21細(xì)胞分為4組:PPV單獨(dú)感染組、PCV2單獨(dú)感染組、PCV2與PPV混合感染組、對(duì)照組。在接種病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各時(shí)間點(diǎn)提取病毒DNA及3D4/21細(xì)胞總RNA。用已經(jīng)建立的real-time PCR法檢測(cè)各組中病毒核酸拷貝數(shù)及IFN-γ，T

9、NF-α，IL-10 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2與PPV單獨(dú)感染組PCV2病毒核酸拷貝數(shù)和PPV病毒核酸拷貝數(shù)分別于36hpi和24hpi高于單獨(dú)感染組;PPV單獨(dú)感染組IFN-γmRNA表達(dá)水平高于PCV2單獨(dú)感染組IFN-γ mRNA表達(dá)水平，PCV2與PPV單獨(dú)感染組IFN-γmRNA表達(dá)水平在12hpi時(shí)高于PCV2單獨(dú)感染組，24hpi后低于對(duì)照組及單獨(dú)感染組;PPV單獨(dú)感染組TNF

10、-αmRNA表達(dá)水平在24hpi后上調(diào)，PCV2單獨(dú)感染組TNF-αmRNA表達(dá)水平在24hpi后上調(diào)，在48hpi后高于PPV單獨(dú)感染組，PCV2與PPV單獨(dú)感染組TNF-αmRNA表達(dá)水平在36hpi后上調(diào)，并明顯高于單獨(dú)感染組;PCV2單獨(dú)感染組IL-10mRNA表達(dá)水平在24hpi及48hpi后輕微上調(diào)，PPV單獨(dú)感染組對(duì)IL-10 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響，PCV2與PPV單獨(dú)感染組1L-10mRNA表達(dá)水平在24hpi后顯著