豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒性疫苗的制備與免疫評價(jià).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus2，PCV2)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜(PostweaningmμLtisystemic wasting syndrome，PMWS)的發(fā)生密切相關(guān)，是其主要原發(fā)病原。PCV2還與豬皮炎腎病綜合征、豬A2型先天性震顫、豬呼吸道病綜合征等傳染性疾病的發(fā)生相關(guān)。PMWS主要流行于5～18周齡的斷奶仔豬，致死率較高，其臨床癥狀主要呈現(xiàn)為:仔豬生長速率降低、體重減輕、呼吸急迫、皮炎、黃疸、淋巴結(jié)

2、病變腫大等。PCV2在世界范圍內(nèi)的感染與流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害與經(jīng)濟(jì)損失。目前對PCV2的防控主要依靠疫苗，國內(nèi)外也先后注冊了全病毒滅活苗、重組嵌合苗和亞單位疫苗，在預(yù)防PCV2感染中發(fā)揮了重要作用。由于進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴，而國產(chǎn)滅活疫苗效果仍不夠理想，因而研制高效、廉價(jià)、安全的新型PCV2亞單位疫苗的需要已日益迫切。
　　基于PCV2結(jié)構(gòu)蛋白(Capsid)能在體外自組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particle

3、s，VLPs)的特性，我們采用大腸桿菌高密度發(fā)酵的方法對重組的Cap蛋白進(jìn)行了可溶性表達(dá)，并純化制備成病毒樣顆粒，為新型PCV2 VLPs亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，本研究主要分為以下幾個(gè)部分:
　　(1)將含有pET28a-ORF2質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21DE3，進(jìn)行了高密度發(fā)酵試驗(yàn)，并對發(fā)酵條件進(jìn)行了摸索，建立了比較穩(wěn)定的10L發(fā)酵罐體系，收獲濕菌體量達(dá)93.9±1.9g/L;且得到的重組Cap蛋白以可溶形式存在，為重組Ca

4、p蛋白的純化及PCV2疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)將高密度發(fā)酵所得菌體進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎。所得上清用硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步除雜，然后采用IEC SP FF陽離子交換層析柱進(jìn)行純化，并對相應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，得到相對純度達(dá)85％以上的Cap蛋白，并對Cap蛋白體外組裝病毒樣顆粒(VLPs)條件進(jìn)行了摸索，成功制備了與PCV2天然病毒結(jié)構(gòu)相似的VLPs。
　　(3)建立評價(jià)PCV2 Cap蛋白體外穩(wěn)定性的雙抗夾心ELISA檢測，

5、使用該方法檢測了不同貯存溫度、不同反復(fù)凍融次數(shù)、不同保護(hù)劑等條件下Cap蛋白的活性變化。結(jié)果顯示，Cap蛋白在25℃以下貯存時(shí)，其活性保持穩(wěn)定;貯存時(shí)不同溫度間變換對蛋白穩(wěn)定性影響較大;在甘氨酸和甘油2種蛋白保護(hù)劑存在條件下蛋白活性的穩(wěn)定性增強(qiáng)。
　　(4)利用高純度Cap蛋白組裝的VLPs作為抗原，分別免疫Balb/c小鼠和仔豬;通過檢測抗體效價(jià)及動(dòng)物的生產(chǎn)性能對疫苗免疫進(jìn)行評價(jià)。小鼠免疫評價(jià)實(shí)驗(yàn)中，VLPs抗原分別與50V礦物

6、油、IMS1313及卡波姆等佐劑按一定比例混合，制備PCV2重組VLPs疫苗;分別將生理鹽水、勃林格豬圓環(huán)病毒2型疫苗分別設(shè)為陰性和陽性對照，對接種后12周內(nèi)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測與分析。結(jié)果顯示，同種劑量情況下，油佐劑免疫效果與陽性對照組相當(dāng)，抗體效價(jià)于第2周開始持續(xù)上升，并長期維持在較高水平，而水性佐劑表現(xiàn)較差。進(jìn)行兩次仔豬臨床生產(chǎn)性能評價(jià)，每次選取150頭仔豬，分為50V油佐劑疫苗注射組、生理鹽水組、勃林格疫苗組，分別在15日齡注射1m

7、L，記錄生產(chǎn)性能。其中第一批免疫生理鹽水組增重率高于勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組，分別為200％、189％、180％，疫苗免疫效果不理想;而在第二批免疫中勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組增重率高于生理鹽水組，分別為296％、304％、252％;表明配制的重組VLPs油佐劑亞單位疫苗有相對較好的免疫效果。
　　本研究的意義在于成功建立了能夠可溶表達(dá)PCV2重組Cap蛋白的大腸桿菌高密度發(fā)酵體系;純化制備純度較高的Cap蛋白，并對