豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗生產(chǎn)質(zhì)量影響因素研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染是造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要原因，其它協(xié)同因素可增強(qiáng)疾病的嚴(yán)重程度。1991年加拿大首次爆發(fā)本病，隨后世界上許多國家和地區(qū)都有本病的報(bào)道。本病以斷奶仔豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血和出現(xiàn)黃疸現(xiàn)象等為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)血清學(xué)調(diào)查和病毒分離鑒定證實(shí)，本病在我國也廣泛存在。
　　 疫苗是預(yù)防此病的主要措施之一。為了有效地預(yù)防PCV2感染，本研究利用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

2、分離鑒定的PCV2-SH株作為疫苗毒株，進(jìn)行了滅活苗的研究，為我國預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　 1.豬圈環(huán)病毒2型規(guī)?；鲋秤绊懸蛩匮芯?br>　　 PCV2體外培養(yǎng)主要采用PK15細(xì)胞，本研究對(duì)細(xì)胞凍存復(fù)蘇條件、血清、細(xì)胞消化傳代方法、接毒和收獲方法等進(jìn)行了條件優(yōu)化，結(jié)果為:復(fù)蘇PK15細(xì)胞采用39℃的溫水60秒內(nèi)迅速溶解，細(xì)胞存活率最好;凍存細(xì)胞加入10％～15％二甲基亞砜，并采取4℃30 min→-

3、20℃2h→-70℃12h→液氮的凍存方法較理想;不同批次的小牛血清對(duì)細(xì)胞生長影響較大，選擇含8％～10％新生血清的DMEM作為細(xì)胞生長液，均能保證細(xì)胞正常生長;胰酶消化前采用hank's液洗滌細(xì)胞，使用1∶4胰酶-EDTA消化液消化，按1∶3-1∶4的比例傳代，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。采用同步接毒方式，收獲的抗原病毒含量最高;每個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶的種毒接毒量為106.5TCID50最為適宜;病毒細(xì)胞維持液采用3％-5％血清的MEM培養(yǎng)基，含毒細(xì)胞

4、的生長良好;含毒細(xì)胞收獲時(shí)經(jīng)-20℃凍融1-3次，病毒含量較高，從而為PCV2滅活疫苗制備提供了依據(jù)。
　　 2.豬圓環(huán)病毒2型滅活與乳化工藝影響因素研究
　　 取PCV2培養(yǎng)物用不同濃度甲醛37℃作用24小時(shí)，用0.2％濃度甲醛作用不同時(shí)間，分別取樣用PCR和間接免疫熒光法檢測(cè)滅活效果，結(jié)果為:用0.2％濃度甲醛37℃滅活20小時(shí)可完全滅活圓環(huán)病毒。用法國進(jìn)口206佐劑為油相，PCV2 SH株滅活抗原為水相，將油相、水

5、相按54∶46的體積比混合到一起進(jìn)行乳化，通過對(duì)乳化過程中的溫度、PH值、攪拌速度、攪拌時(shí)間、降溫方式等進(jìn)行試驗(yàn)，然后對(duì)成品苗進(jìn)行乳化效果的檢測(cè)和判定，結(jié)果為:當(dāng)水相的PH值為8.2，水相、油相溫度為32℃，攪拌速度為50HZ,攪拌時(shí)間為30分鐘時(shí)乳化效果最好。將按上述方法乳化合格的3批PCV2滅活疫苗按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行物理性狀和無菌檢測(cè)，均符合要求。
　　 3.豬圓環(huán)病毒2型滅活苗安全性與免疫效力試驗(yàn)
　　 選擇14～21

6、日齡仔豬，用3批滅活疫苗接種，每頭肌肉注射疫苗4ml，進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，連續(xù)觀察14日，均無異常臨床反應(yīng)。免疫兩次，每次免疫1ml，兩周后加強(qiáng)免疫一次，于首次免疫后1、2、3、4周采血，分離血清，用間接ELISA測(cè)定PCV2抗體，結(jié)果為:3批滅活疫苗免疫豬體后都可以檢測(cè)到特異性抗體，免疫2周后開始產(chǎn)生抗體，免疫4周抗體水平達(dá)到最高，而非免疫組始終未檢測(cè)到特異性抗體。采用5～6周齡清潔級(jí)小白鼠免疫，每只0.2ml，兩周后按相同途徑和劑量進(jìn)行