豬巴氏桿菌病滅活疫苗菌株的篩選.pdf

1、在中國(guó)豬巴氏桿菌病主要是由A型和D型多殺性巴氏桿菌引起，但國(guó)內(nèi)尚無同時(shí)含有A型和D型多殺性巴氏桿菌的疫苗，這給豬巴氏桿菌病的防控帶來極大困難。本研究以篩選的5株A型和5株D型豬源PM強(qiáng)毒菌株為研究對(duì)象，對(duì)其生化特征、生長(zhǎng)特性、16S rRNA基因分子特征、藥敏試驗(yàn)、毒力特性及免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　革蘭染色鏡檢結(jié)果表明，10株P(guān)M強(qiáng)毒菌株的菌體形態(tài)一致，均為有莢膜、呈兩極深染的革蘭氏陰性短小桿菌。生長(zhǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果

2、表明，不同菌株在含新生牛血清（終濃度5％）的TSA固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度有明顯差異，A型比D型生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)36h后A型PM的菌落平均直徑為6.07mm，D型PM平均直徑為4.49mm。在TSB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，5株A型和5株D型 PM的最高活菌含量分別介于2.4×109~4.3×109cfu/ml和2.8×109~5.5×109cfu/ml，均能高密度發(fā)酵培養(yǎng)。21種生化試驗(yàn)的反應(yīng)結(jié)果表明，10株P(guān)M的生化反應(yīng)均不

3、一致，即使同一血清型的不同菌株之間也具有較大差別。
　　藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明10株多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒菌株對(duì)阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢克洛、頭孢拉定、阿奇霉素、氯霉素、恩諾殺星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星均高度敏感，其他11種抗生素的敏感性不同。基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，10株細(xì)菌與 PM多殺亞種標(biāo)準(zhǔn)株 HN06和禽殺亞種標(biāo)準(zhǔn)株 P1059聚為一簇，且置信度達(dá)98.6%。
　　基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示

4、，10株細(xì)菌與 PM多殺亞種標(biāo)準(zhǔn)株 HN06和禽殺亞種標(biāo)準(zhǔn)株 P1059聚為一簇，且置信度達(dá)98.6%。16S rRNA基因的序列分析結(jié)果表明，16S rRNA基因非常保守，10株 PM之間的同源性均在99.8%以上；在1505bp序列中，僅存在第57bp（ T/C）、239bp（T/C）和376bp（G/C）處3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并且不具有型特異性。
　　小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，5株A型PM強(qiáng)毒菌株的小鼠LD50介于4~26 cfu，

5、5株D型 PM強(qiáng)毒菌株的小鼠LD50介于2.1×104~5.2×105cfu，A型PM強(qiáng)毒菌株的毒力明顯強(qiáng)于D型 PM強(qiáng)毒菌株。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合兩次免疫保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果，A型多殺性巴氏桿菌中具有良好免疫保護(hù)力的3個(gè)菌株確定為 PM-31、PM-41和 PM-45。D型多殺性巴氏桿菌中具有良好免疫保護(hù)力的3個(gè)菌株依次為 PM-15、PM-35、PM-17。將這3株 A型和3株 D型多殺性巴氏桿菌作為進(jìn)一步研究開發(fā)豬巴氏桿菌病二價(jià)滅