草魚出血病細胞滅活疫苗的免疫效果評價.pdf

1、目的:
　　草魚是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖“四大”家魚之一，為我國淡水養(yǎng)殖第一品種。但是多年來，草魚細菌病及病毒病的多發(fā)嚴重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。尤其是草魚出血病，其發(fā)病快、流行廣、死亡率高，是危害草魚最為嚴重的病毒性疾病。單靠藥物是無法解決日益嚴重的草魚出血病的蔓延，而使用高效的疫苗免疫是最有效的預防措施，因此疫苗研制對該病的防治意義重大。如何評價疫苗的有效性是疫苗研制及其合理使用的重要方法。結(jié)合分子生物學技術(shù)和免疫學技術(shù)，建立更準確

2、、有效的疫苗評價方法是我們一直努力的目標，它不僅為豐富魚類免疫學及疫苗免疫機理的研究提供基礎數(shù)據(jù)，也為疫苗的開發(fā)應用提供技術(shù)手段。
　　方法:
　　1.用巢式PCR檢測方法對本實驗室保存的草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)分離株進行GCRV基因型分型。
　　2.采用草魚腎細胞(CIK)培養(yǎng)方法分別對GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13進行擴大培養(yǎng)。
　　3.制備基因Ⅰ型、Ⅱ型

3、GCRV的標準質(zhì)粒，采用絕對熒光定量PCR(absolutequantification PCR，AQ-PCR)方法分別測定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒拷貝數(shù);并采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissue culture infectious dose50，TCID50)分別測定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒滴度。
　　4.將GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13按病毒拷貝數(shù)測定結(jié)果同比例混合，

4、混合病毒液用甲醛滅活后制備細胞滅活疫苗，設置原液、50倍和100倍生理鹽水稀釋及生理鹽水對照共4組;分別腹腔注射免疫20g±5g健康草魚，各組于0h及免疫后各時間點取草魚脾臟組織及血液。
　　5.草魚出血病細胞滅活疫苗免疫效果評價:
　　(1)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測:選取草魚主要的6種免疫因子編碼基因作為候選基因，包括草魚免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、主要組織相容性復合體Ⅰ(major hist

5、ocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)、1型干擾素(interferon1，IFN1)、補體3(complement3，C3)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、內(nèi)凝集素(intelectin))，采用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測草魚經(jīng)注射免疫不同劑量草魚出血病滅活疫苗前后脾細胞中上述免疫基因的表達，采用2-ΔΔCt方法

6、處理數(shù)據(jù)，并用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析。
　　(2)抗體水平評價:
　?、俨蒴~IgM重鏈蛋白的表達及純化，并制備鼠抗多克隆抗體，western blot方法檢測其特異性，該抗體用做TAS-ELISA檢測草魚免疫抗體水平的中間抗體。
　?、诨颌裥虶CRV-ZV8909結(jié)構(gòu)蛋白VP7蛋白表達及純化，并制備多克隆抗體，western blot方法檢測其分別與GCRV-ZV8909、GCRV-HZ13的反應。
　　

7、③分別用純化的基因Ⅰ型GCRV-ZV8909的結(jié)構(gòu)蛋白VP7蛋白及濃縮提純的基因Ⅱ型GCRV-HZ13作為包被抗原，鼠抗草魚IgM血清作為中間抗體，建立TAS-ELISA方法檢測草魚體液免疫應答產(chǎn)生的抗體水平。
　　(3)免疫保護率測定:用本實驗室分離的基因Ⅱ型GCRV-HZ13對免疫組及對照組草魚進行攻毒實驗。
　　結(jié)果:
　　1.GCRV的分型
　　GCRV-ZV8909屬于基因Ⅰ型，GCRV-HZ13屬于基

8、因Ⅱ型。
　　2.GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的病毒含量
　　運用AQ-PCR對GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的RNA拷貝數(shù)進行定量，結(jié)果表明基因Ⅰ型GCRV-ZV8909拷貝數(shù)為2.0×109 copies/mL，而基因Ⅱ型GCRV-HZ13拷貝數(shù)為1.5×106copies/mL。病毒滴度測定結(jié)果表明GCRV-ZV8909的TCID50為1.0×106.83TCID50/mL, GCRV-HZ1

9、3的TCID50為1.0×104.83 TCID50/mL。
　　3.從免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測草魚出血病滅活疫苗免疫效果
　　注射免疫不同劑量的草魚出血病滅活疫苗均能刺激草魚脾臟中6種主要免疫基因不同程度的上調(diào)表達，說明疫苗刺激機體啟動了非特異性和特異性免疫應答。在3個疫苗免疫組中，基因Intelectin、MHCⅠ、IL-1β、C3的相對表達量都隨著時間的推移出現(xiàn)了先上調(diào)后下降的趨勢;基因IFN1的相對表達量在6h時達到

10、高峰，之后逐漸下降直至正常水平;基因IgM的相對表達量則呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的趨勢。
　　4.抗體水平評價
　　(1)通過PCR擴增，蛋白重組表達，成功獲得GCRV-ZV8909的VP7蛋白及草魚IgM蛋白。將純化的VP7蛋白及IgM蛋白分別注射小鼠后獲得鼠抗VP7血清及鼠抗草魚IgM血清。
　　(2) Western blot方法檢測鼠抗VP7血清及鼠抗草魚IgM血清的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的2種多抗血清具有較好的特異性，間

11、接ELISA實驗結(jié)果顯示鼠抗草魚IgM血清效價在1∶3200。
　　(3) TAS-ELISA結(jié)果表明，草魚經(jīng)腹腔注射不同劑量的細胞滅活疫苗后，與對照組相比，各免疫組血清抗體均有不同程度的提高，且原液組與50倍稀釋組基本持平，但都高于100倍稀釋組，各免疫組在免疫后5d就可檢測到抗基因Ⅰ型GCRV抗體和基因Ⅱ型GCRV的抗體，且抗體水平持續(xù)到84d，但兩種基因型抗體水平達到高峰的時間不一致，抗基因Ⅰ型GCRV抗體達到高峰是在28d

12、，抗基因Ⅱ型GCRV抗體是在14d達到高峰。兩種基因型抗體水平達到高峰時的血清效價分別是1∶800，1∶600。
　　5、免疫保護率
　　原液組的免疫保護率為67％，50倍稀釋組的免疫保護率為60％，100倍稀釋組的免疫保護率為33％。
　　結(jié)論:
　　1.與對照組相比，免疫組不同濃度的疫苗均能誘導草魚脾臟中免疫相關(guān)分子基因的表達上調(diào)。
　　2.所建立的TAS-ELISA方法可初步應用于檢測草魚出血病細胞滅