虹鱒魯氏耶爾森菌分離鑒定及其滅活疫苗的免疫效果評價.pdf

1、魯氏耶爾森菌為耶爾森菌屬之一，該菌為冷水魚暴發(fā)細(xì)菌性敗血癥的常見致病菌，水產(chǎn)養(yǎng)殖中該菌引發(fā)魚類死亡率較高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2013年在青海及北京房山冷水魚養(yǎng)殖基地從患病虹鱒魚肝臟和脾臟均分離到此種致病菌，患病虹鱒出現(xiàn)吻端紅腫、體表出血、有紅色囊腫包裹肛門等臨床病癥，內(nèi)部臟器官均有不同程度的病變，根據(jù)此癥狀初步判斷其為腸炎紅嘴病。從分離得到的致病中選取致病性較高的一株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)研究，該菌株命名為BH1206株。目

2、前該病已成為冷水魚養(yǎng)殖的一種多發(fā)性疾病，因此，有必要對該疾病病原學(xué)及其防控進(jìn)行深入研究，為虹鱒腸炎紅嘴病的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究在無菌條件下，從患病未發(fā)現(xiàn)寄生蟲虹鱒魚的肝臟和脾臟采用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)分離并純化出一株命名為BH1206的致病性菌株。并用該菌對健康虹鱒進(jìn)行人工感染試驗(yàn)表明，BH1206株為患有腸炎紅嘴虹鱒的病原菌。對健康虹鱒魚進(jìn)行階梯濃度致病菌的人工感染試驗(yàn)，來確定該菌的半致死濃度(LD50);

3、對患病虹鱒魚的肝臟、脾臟、腎臟等組織器官進(jìn)行病理切片，并觀察病變部位和致病部位;對菌落形態(tài)觀察與并用生理生化試驗(yàn)以及16S rRNA測序、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該致病的分類地位;控制不同的溫度、鹽度、pH三個培養(yǎng)因素來確定該菌的最適合生長條件;采用擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，明確該菌對抗生素的敏感程度;采用注射免疫和浸泡免疫兩種方法對虹鱒魚進(jìn)行滅活苗免疫，并通過攻毒實(shí)驗(yàn)確定其免疫保護(hù)率。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)從患病虹鱒魚肝臟

4、和脾臟分離純化到一株高致病性菌并命名為BH1206株，通過普通生化試劑管、API20E試劑盒、Biolog系統(tǒng)以及16SrRNA分子測序鑒定，確定該菌為魯氏耶爾森菌。通過控制溫度、鹽度、pH三個方面明確BH1206株在溫度低于15℃及高于40℃環(huán)境下不生長，在28℃-30℃生長狀態(tài)最佳，在pH6-pH10范圍內(nèi)生長，在pH6.5-pH7.5范圍內(nèi)生長狀態(tài)最佳，NaCl含量在3％內(nèi)生長并且NaCl含量為0生長狀態(tài)最佳。
　　(2)藥

5、敏試驗(yàn)結(jié)果表明BH1206菌株對利福平、多粘菌素、阿莫西林完全耐藥，對復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素、羧芐青霉素、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、氨芐西林、青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、氯霉素、呋喃唑酮、新霉素均有不同程度的敏感，對氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素和呋喃唑酮中度敏感;對紅霉素、利福平、阿莫西林、多粘菌素B不敏感。
　　(3)攻毒試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析得到BH1206的半致

6、死濃度為6.46×107CFU/mL，病理組織切片中可以觀察到肝臟和脾臟細(xì)胞壞死，產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞，腸道組織極度萎縮變形，腎臟也有明顯病變。
　　(4)免疫試驗(yàn)結(jié)果表，300℃d·后浸泡免疫組1×109cells/mL菌液的免疫保護(hù)率為75.0％，浸泡免疫組1×107cells/mL菌液的免疫保護(hù)率為71.16％，浸泡組對照組的免疫保護(hù)率為3.53％;注射免疫組1×109cells/mL菌液的免疫保護(hù)率為89.09％，注射免疫組