鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌二聯(lián)口服疫苗制備及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰是我國(guó)一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。近年來(lái)，越來(lái)越多的細(xì)菌性疾病困擾著斑點(diǎn)叉尾鮰的健康養(yǎng)殖，其中鮰愛德華氏菌病和魯氏耶爾森氏菌病危害尤為嚴(yán)重。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防控目前主要采用抗生素，但由此也帶來(lái)了諸如細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留、食品安全和環(huán)境污染等問(wèn)題。作為最為有效的疾病防控方式，疫苗的使用勢(shì)在必行。采用高分子材料為載體制備漁用口服疫苗已成為當(dāng)今漁用疫苗研究的熱點(diǎn)。本研究以天然高分子材料海藻酸鈉為疫苗載體，制備了針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰

2、鮰愛德華氏菌病和魯氏耶爾森氏菌病的二聯(lián)口服微球疫苗，并評(píng)價(jià)了免疫保護(hù)效果。具體研究?jī)?nèi)容包括:
　　1、響應(yīng)面法優(yōu)化口服微球疫苗制備工藝及其特性分析
　　為優(yōu)化漁用口服微球疫苗制備工藝，實(shí)驗(yàn)以天然高分子聚合物海藻酸鈉為載體，鮰愛德華氏菌滅活疫苗為抗原模型，采用響應(yīng)面法優(yōu)化海藻酸鈉口服微球疫苗制備工藝，并參照最佳工藝分別制備鮰愛德華氏菌口服微球疫苗和魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究海藻酸鈉濃度、水油相比例、乳化劑濃

3、度以及乳化時(shí)間對(duì)微球疫苗包封效率的影響。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化海藻酸鈉微球疫苗的制備工藝。結(jié)果表明最佳制備工藝條件為:海藻酸鈉濃度3.5％，水油相比例2.4∶7.6，乳化劑濃度5.4％，乳化時(shí)間13min。對(duì)制備的微球特性分析表明，以最佳工藝條件制備的鮰愛德華氏菌微球疫苗和魯氏耶爾森氏菌微球疫苗成球性好，粒徑分布均勻，粒徑（8.88±1.26）μm、（8.76±1.73）μm，跨距0.3

4、8、0.47，包封效率96.37％、94.51％，具有較好抗酸性、腸溶性以及高安全性的特點(diǎn)。
　　2、口服微球疫苗免疫效果評(píng)價(jià)
　　為評(píng)價(jià)海藻酸鈉口服微球疫苗的免疫效果，實(shí)驗(yàn)按優(yōu)化后的制備工藝制備鮰愛德華氏菌微球疫苗和魯氏耶爾森氏菌微球疫苗，口服免疫斑點(diǎn)叉尾鮰，對(duì)血清總蛋白、總超氧化物歧化酶、溶菌酶及抗體效價(jià)等免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析，通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)疫苗免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，免疫微球疫苗后的斑點(diǎn)叉尾鮰，血清中總蛋白含量

5、、溶菌酶活力、總超氧化物歧化酶活力均得到顯著提高;鮰愛德華氏菌微球疫苗組血清凝集效價(jià)峰值出現(xiàn)在第5周，最高1∶16，至免疫后第7周仍可檢測(cè)到特異性抗體;魯氏耶爾森氏菌微球疫苗組血清凝集效價(jià)峰值出現(xiàn)在第5周，最高1∶8，至免疫后第8周仍能檢測(cè)到特異性抗體。分別用鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌進(jìn)行攻毒，口服鮰愛德華氏菌微球疫苗的斑點(diǎn)叉尾鮰獲得的抗鮰愛德華氏菌相對(duì)免疫保護(hù)率為60.7％;口服魯氏耶爾森氏菌微球疫苗的斑點(diǎn)叉尾鮰獲得的抗魯氏耶爾森氏

6、菌相對(duì)免疫保護(hù)率為65.5％。綜上所述，實(shí)驗(yàn)制備的鮰愛德華氏菌微球疫苗和魯氏耶爾森氏菌微球疫苗能夠?qū)︴t愛德華氏菌病和魯氏耶爾森氏菌病起到較好的預(yù)防作用。
　　3、二聯(lián)口服微球疫苗免疫效果評(píng)價(jià)
　　為評(píng)價(jià)鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌二聯(lián)海藻酸鈉口服微球疫苗免疫效果，實(shí)驗(yàn)制備鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌二聯(lián)微球疫苗，以斑點(diǎn)叉尾鮰為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，口服免疫，設(shè)二聯(lián)微球疫苗低、中、高三個(gè)免疫劑量。選擇血清總蛋白、總超氧化物歧化酶、溶菌酶及

7、抗體效價(jià)等免疫指標(biāo)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組血清進(jìn)行檢測(cè)分析，通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)疫苗免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用熒光定量PCR檢測(cè)口服疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果表明，二聯(lián)微球疫苗能更長(zhǎng)時(shí)間的提高非特異性免疫功能，至免疫后第6周二聯(lián)微球疫苗低、中、高劑量組非特異性免疫指標(biāo)均與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)。二聯(lián)微球疫苗低、中、高劑量組抗體效價(jià)峰值均出現(xiàn)在第5周，二聯(lián)微球疫苗低劑量組最高，抗鮰愛德華氏菌特異性抗體和抗魯氏耶爾森氏菌特異性抗體分

8、別為1∶32和1∶16。攻毒后，二聯(lián)微球疫苗低、中、高劑量組分別可獲得抗鮰愛德華氏菌相對(duì)免疫保護(hù)率為75.0％、67.9％和60.7％;抗魯氏耶爾森氏菌相對(duì)免疫保護(hù)率為65.5％、69.0％和65.5％。熒光定量分析結(jié)果顯示，在頭腎和脾臟中二聯(lián)微球疫苗低劑量組IL-1β1的表達(dá)量都極顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P＜0.01); TNF-α、MHC-Ⅱβ、CD4L-2的表達(dá)量均為二聯(lián)微球疫苗低劑量組或中劑量組最高。研究表明，鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾