鴨源多殺性巴氏桿菌油乳劑滅活疫苗的制備與應(yīng)用.pdf

1、本研究選取分離自某發(fā)病鴨場(chǎng)的菌株，經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離鑒定為鴨源多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，PM），并用此菌株作為制苗菌株，用甲醛滅活后與礦物油佐劑高速乳化混勻，制備鴨源多殺性巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗。通過(guò)對(duì)試制疫苗的物理性狀、疫苗的無(wú)菌檢測(cè)，疫苗的安全性檢測(cè)，對(duì)同源毒株的攻毒保護(hù)性試驗(yàn)，采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzye Linked Immunosorbent Assay，ELISA)對(duì)試驗(yàn)鴨和養(yǎng)殖場(chǎng)鴨產(chǎn)生的

2、特異性抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)，完成對(duì)該疫苗的安全性、免疫效力等評(píng)估。
　　1.細(xì)菌的分離鑒定:本研究菌株選取于某發(fā)病鴨場(chǎng)，挑取病料的心血，肝臟，接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)菌生物學(xué)培養(yǎng)特性、API20NE生化試紙條和16s rRNA基因PCR鑒定結(jié)果表明該菌株為多殺性巴氏桿菌;Bioiog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果表明分離菌株為多殺性巴氏桿菌多殺亞型;PCR莢膜分子分型鑒定結(jié)果為莢膜A型多殺性巴氏桿菌。
　　2.

3、疫苗的物理性狀及無(wú)菌檢測(cè):疫苗的物理性狀通過(guò)從疫苗的外觀，劑型，黏稠度，穩(wěn)定性四個(gè)方面來(lái)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該疫苗符合油佐劑疫苗制備的基本標(biāo)準(zhǔn)。然后將制作好的疫苗取少量于血瓊脂平板、TSA平板，每次接種0.2mL，觀察24～72h有無(wú)細(xì)菌成長(zhǎng)，結(jié)果表明72h內(nèi)培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，證明該疫苗無(wú)菌檢測(cè)合格。
　　3.疫苗安全性檢測(cè):該疫苗經(jīng)過(guò)物理性質(zhì)檢測(cè)及無(wú)菌檢測(cè)合格后，對(duì)30日齡健康鴨肌肉注射1 mL/只，觀察7d，結(jié)果表明免疫試驗(yàn)鴨后未

4、出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，試驗(yàn)鴨成長(zhǎng)良好。
　　4.攻毒保護(hù)試驗(yàn):油劑疫苗經(jīng)過(guò)無(wú)菌及安全檢測(cè)合格后，對(duì)30日齡試驗(yàn)鴨肌肉注射1mL/只。于免疫后14d，28d進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，多殺性巴氏桿菌攻毒菌量為4.5×108CFU/mL。結(jié)果表明試驗(yàn)鴨免疫后14d對(duì)同源PM強(qiáng)毒的保護(hù)率為80％，試驗(yàn)鴨免疫后28d對(duì)同源強(qiáng)毒株的保護(hù)率為100％。
　　5.間接ELISA檢測(cè)抗體水平消長(zhǎng):采用鴨源多殺性巴氏桿菌的全菌超聲波裂解抗原為包被抗原，用方

5、陣法確定了多殺性巴氏桿菌抗原的最佳包被濃度和HRP-羊抗鴨IgG的最佳濃度，分別為1.1μg/mL、0.33μg/mL。油劑疫苗經(jīng)過(guò)無(wú)菌和安全性檢測(cè)合格后，對(duì)6只30日齡健康鴨肌肉注射1 ml/只。于試驗(yàn)鴨免疫后0d，3d，6d，9d，12d,15d,21d,28d,35d,42d,49d,56d,63d,70d,77d,84d,91d,98d,104d測(cè)定血清抗體效價(jià)。結(jié)果表明6d左右可檢測(cè)出抗體的存在，隨著時(shí)間的推移，試驗(yàn)鴨的抗體水

6、平逐步升高，在免疫后的28d達(dá)到最高值，之后抗體水平逐漸下降，到免疫后的91d仍然維持較高的抗體水平，而且在91d的抗體水平強(qiáng)于12d的免疫水平，至免疫104d后仍能檢測(cè)出抗體的存在。
　　6.疫苗的實(shí)踐應(yīng)用:試制疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)安全有效，符合制苗生產(chǎn)的基本要求后，將制備好的疫苗大量接種于某鴨場(chǎng)30日齡的成年鴨，用于生產(chǎn)推廣應(yīng)用，觀察臨床效果，并采血清樣本送回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)其抗體水平。結(jié)果表明該鴨場(chǎng)免疫疫苗后該病的發(fā)生明顯減少，免疫鴨