牛源A型多殺性巴氏桿菌PM0979蛋白的功能研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）為球桿狀或短桿狀的革蘭氏陰性菌，根據莢膜抗原主要分為A、B、D、E和F5種莢膜血清型，根據菌體抗原分為1～16個血清型。多殺性巴氏桿菌能夠引起牛羊等多種動物的感染，導致急慢性傳染性疾病，其癥狀包括牛出血性敗血癥、牛肺炎、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂、兔出血性敗血癥等。已有文獻報道，人被犬貓抓傷后感染多殺性巴氏桿菌可引起局部組織損傷，甚至導致全身系統(tǒng)性疾病。該病不僅嚴重威脅

2、動物及人類的身體健康，也給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。近年來，隨著肉牛養(yǎng)殖的發(fā)展，牛多殺性巴氏桿菌病的流行呈現上升趨勢，而牛群感染大多以A型多殺性巴氏桿菌所致的牛肺炎為主。
　　多殺性巴氏桿菌毒力因子在致病機制中占有至關重要的作用，如粘附素、莢膜、脂多糖、外膜蛋白、鐵調控蛋白和毒素等。外膜蛋白是外膜中鑲嵌的多種蛋白質的總稱，脂蛋白是外膜蛋白的一種，具有粘附宿主、抵御毒素入侵、影響生物膜形成等作用，在細菌對宿主的感染和致病過程中起著重

3、要的作用。根據報道，脂蛋白E（PlpE）作為重要的毒力因子，具有較好的免疫原性，可作為良好的疫苗候選。實驗室前期研究發(fā)現，PM0979蛋白可能是細胞膜的組成成分，且其重組蛋白具有較好的免疫原性，但目前對其功能的研究尚不清楚。本研究首先通過生物信息學軟件分析PM0979的蛋白結構和可能的細胞定位；同時，采用熒光定量PCR檢測Pm0979基因的體內外表達情況。其次，通過間接免疫熒光分析其細胞定位。最后，通過體外實驗研究其刺激巨噬細胞產生炎癥

4、細胞因子的能力；同時，以A型多殺性巴氏桿菌為研究對象，構建Pm0979基因的突變株，并通過體內實驗初步探究其功能。
　　1.多殺性巴氏桿菌pm0979基因的生物信息學及體內外表達差異分析
　　本試驗利用 SignalP-4.1 server及 TMHMM Server v2.0在線分析軟件對PM0979進行信號肽和跨膜結構域的生物信息學分析，結果顯示，PM0979蛋白的1-20aa為信號肽區(qū)域，無跨膜結構域；利用DOLOP在

5、線分析程序以及LipoP1.0 server在線分析軟件對PM0979蛋白進行脂蛋白的預測分析，預測其為假定的脂蛋白；利用CELLOv.2.5在線分析軟件進行Pm0979基因細胞定位的預測，預測結果該蛋白定位在細胞膜與外膜之間；利用 Clustalx1.83分析軟件進行 Pm0979基因的同源性分析比較，結果顯示，基因 Pm0979在A型菌株和B型菌株中保守性極高，在D型菌株、F型菌株和羊源菌株中存在單堿基的突變，提示PM0979蛋白定

6、位在胞外且與巴氏桿菌多種血清型菌株同源性高。在以上結果基礎上，以本實驗室不同血清型菌株 PmA、PmB、PmF為模板，通過熒光定量 PCR檢測Pm0979基因的體外表達情況。結果顯示，Pm0979基因在 PmA、PmB、PmF型菌株的體內外均表達且有一定差異。
　　2. Pm0979基因的原核表達及其蛋白的細胞定位分析
　　通過設計引物PCR擴增PmCQ2菌株的Pm0979基因，以PET-32a（+）為載體構建重組質粒，IP

7、TG誘導表達重組蛋白rPM0979。通過超聲波破碎菌體后保留上清，進行SDS-PAGE檢測及可溶蛋白rPM0979的純化除鹽，制備rPM0979的小鼠血清抗體。以PmCQ2為研究對象，通過間接免疫熒光試驗（IFA）檢測PM0979蛋白在PmCQ2菌株中的分布特征。結果顯示透化組的PmCQ2呈現翠綠色熒光信號，未透化組和陰性組的PmCQ2沒有任何信號，表明rPM0979抗體能夠特異地識別Pm細胞壁內的抗原，并與之發(fā)生免疫反應，推測該蛋白可

8、能分布于細菌的膜上。
　　3.多殺性巴氏桿菌PM0979致病性研究
　　分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞，并將可溶蛋白rPM0979與巨噬細胞共培養(yǎng)24h，通過ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細胞因子。結果顯示，rPM0979誘導巨噬細胞后TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細胞因子均上調，TNF-α、IL-6及IL-18的上調與對照組相比差異極顯著，IL-1β差異顯著。該結果提示PM097

9、9可能參與多殺性巴氏桿菌致炎作用。
　　以PmCQ2基因組為模板PCR擴增Pm0979基因的上下游同源臂，將其克隆至質粒PUC19oriKanR相應的酶切位點，構建重組轉移質粒PUC19oriKanR-△0979。將重組轉移質粒電轉化至感受態(tài)中，在抗性培養(yǎng)基上進行篩選，PCR檢測及Western blot驗證，構建PmCQ2菌株的Pm0979基因突變株。檢測突變株對生化試驗，生長曲線，生物膜形成的影響。結果顯示，PmCQ2-△09

10、79突變株與野毒株PmCQ2的生化特性一致；體外37℃培養(yǎng)，PmCQ2-△0979突變株生長速度與野毒株 PmCQ2無差異；值得注意的是，PmCQ2-△0979突變株生物膜形成能力減弱；同時，通過體內及體外實驗檢測PM0979對巴氏桿菌毒力的影響，動物攻毒試驗顯示，PmCQ2-△0979突變株腹腔攻毒小鼠后死亡率為75%，而野生型PmCQ2為100%。說明PmCQ2-△0979突變株毒力減弱；ELISA檢測PmCQ2-△0979突變株感