豬博卡病毒間接ELISA方法的建立及與PCV2共感染對(duì)細(xì)胞的影響.pdf

1、豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)是瑞典研究人員于2009年在患病豬中檢測(cè)到的，常在發(fā)生仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、腹瀉和呼吸道疾病的豬群中檢出，國(guó)內(nèi)外研究表明PBoV在患病豬群和健康豬群中均存在。目前對(duì)于PBoV致病性仍然存在爭(zhēng)議，推測(cè)該病毒致病性較弱，需要與其他病毒協(xié)同發(fā)揮致病作用。臨床上與其他病毒存在雙重和多重感染，尤其與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type2，PCV2)感染檢出率高，我

2、們推測(cè)PCV2可能在該病毒致病過(guò)程中起著重要作用。本研究選擇豬博卡病毒VP1的優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行基因克隆和原核表達(dá)，利用重組蛋白初步建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法。同時(shí)通過(guò)PBoV單獨(dú)感染及與PCV2混合感染豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)，初步探討該病毒對(duì)IPEC-J2的感染能力，以及PCV2對(duì)PBoV感染的協(xié)同作用。具體研究主要有以下兩部分:
　　1.豬博卡病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立
　　擴(kuò)增豬博卡病毒NP08

3、株部分VP1基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-tVP1，原核表達(dá)獲得大小為56.7kDa的重組蛋白。用重組VP1蛋白作為包被抗原，初步建立PBoV的間接ELISA抗體檢測(cè)方法。與Western blot結(jié)果符合率在81.25％，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10％。應(yīng)用本方法對(duì)12個(gè)場(chǎng)832份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，PBoV抗體陽(yáng)性率25.6％，其中腹瀉豬群抗體陽(yáng)性率32.65％(207/634)，健康豬群抗體陽(yáng)性率3.03％(6/198)。

4、r>　　2.PBoV與PCV2共感染對(duì)細(xì)胞影響的研究
　　(1)將PBoV、PCV2單獨(dú)或混合接種豬腎細(xì)胞(PK-15)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組、PCV2組細(xì)胞無(wú)病變，PBoV感染組及混合感染組出現(xiàn)不同程度堆積、脫落等細(xì)胞病變，且混合感染組比單獨(dú)感染組細(xì)胞病變明顯。然而，Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCV2并不能促進(jìn)PBoV在PK-15細(xì)胞上增殖，且與感染先后順序無(wú)關(guān)。
　　(2)將PBoV、PCV2單獨(dú)或混合接種IPEC-J

5、2，HE染色發(fā)現(xiàn)感染組細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，細(xì)胞病變主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)降解變稀薄、有空洞現(xiàn)象。病毒感染24h后收集細(xì)胞，PBoV和PCV2單獨(dú)感染細(xì)胞凋亡率分別為6.70％和6.29％，而PBoV和PCV2同時(shí)感染細(xì)胞凋亡率為10.8％，明顯高于單獨(dú)感染組。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCV2并不能促進(jìn)PBoV在IPEC-J2細(xì)胞上增殖，且與感染先后順序無(wú)關(guān);PBoV也不能促進(jìn)PCV2在IPEC-J2細(xì)胞上增殖。混合感染后四種炎

6、性因子(IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均比單獨(dú)感染后有極顯著上調(diào)(P＜0.001);對(duì)IPEC-J2跨膜上皮電阻值測(cè)定:感染組在1h時(shí)TEER值極速下降后上升，在12h時(shí)又下降，12-84h期間TEER趨于平穩(wěn);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)感染組OCLN、CLDN1、ZO-1表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)，主要發(fā)生在細(xì)胞感染早期。
　　總之，本研究首次探討了PCV2對(duì)PBoV在細(xì)胞水平增殖和致病性的影響，發(fā)現(xiàn)混合感