重組人干擾素慢病毒共感染對5型腺病毒體外復(fù)制的影響.pdf

1、基于HIV-1的重組慢病毒載體(LV)以其獨特優(yōu)點正成為病毒性疾病基因治療領(lǐng)域的研究熱點。一方面它作為一種載體,能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞,持續(xù)且穩(wěn)定地表達目的基因,可感染靜息期和增殖期的細胞,不易引起宿主的免疫原性反應(yīng)。在相關(guān)研究中,帶有干擾素-β(IFN-β)基因的LV高效轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+/PBMC,在細胞內(nèi)外高效表達IFN-β,顯著抑制HIV-1毒株的復(fù)制,表現(xiàn)出了抗HIV感染能力。另一方面,LV是由HIV病毒去除毒力基因改建而來,LV預(yù)先感染靶

2、細胞,可能會對靶細胞起到保護作用,能干預(yù)或阻斷野生毒株的再感染。悉尼血庫(Sydney Bank Cohort,SBBC)的一份關(guān)于關(guān)于艾滋病人長期生存的調(diào)查報告表明,HIV-1 nef缺失減毒株共感染,能顯著延長HIV-1感染者的生存期。本實驗室前期研究表明,在HIV感染的人群中,GBV-C的病毒載量和HIV-1病毒載量存在著負相關(guān)性,CD4+細胞數(shù)目和GBV-C病毒載量存在著正相關(guān)性。GBV-C或HIV-1 nef缺失的減毒株的共感

3、染可能對HIV-1感染靶細胞起到一定的保護作用,抵抗HIV-1的感染。這種抵抗能力可能取決于宿主體內(nèi)的靶細胞預(yù)感染率和持續(xù)時間。在自然狀況下,GBV-C或缺失nef的HIV-1減毒株共感染抵抗HIV-1感染的作用較弱,可能是與不能保護足夠數(shù)量的靶細胞有關(guān)。
　　 我們假設(shè),如構(gòu)建一種攜帶干擾素(IFN)的重組慢病毒,高效轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞,發(fā)揮病毒持續(xù)性共感染及IFN雙重抗病毒作用,可能會探索出一種治療病毒性疾病的新的途徑。
　　

4、 基于這個科學(xué)假說,首先制備了不同啟動子的重組慢病毒,測定對不同細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。實驗構(gòu)建了含EF1α、CMV、Ubiquitin三種不同啟動子的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,進而采用脂質(zhì)體lip2000共轉(zhuǎn)染三質(zhì)粒載體系統(tǒng)方法,包裝攜帶有綠色熒光蛋白的重組LV。針對轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的3'-LTR部分,設(shè)計了用以測定LV載量的探針和引物,采用熒光定量PCR方法,測定包裝的LV載量。用LV轉(zhuǎn)導(dǎo)293A、MOLT-4、PC3、DU145、RM1細胞系及外周血單個核細胞

5、,比較不同內(nèi)部啟動子的LV在各種細胞系中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,并監(jiān)測目的基因GFP在293A細胞中能否持續(xù)穩(wěn)定的表達。高效包裝的帶有綠色熒光蛋白的重組LV,載量為109 copies/ml以上,過濾濃縮后可達1011 copies/ml。不同啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白表達效果比較:以293A和PC3為靶細胞時,CMV啟動子作用最強；以MOLT-4和DU145為靶細胞時,EF-1α啟動子作用最強；在RW1細胞中,三種啟動子的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均較低,但Ub

6、iquitin啟動子作用略強。GFP在293A細胞中能夠持續(xù)穩(wěn)定表達,連續(xù)監(jiān)測1個月,細胞狀態(tài)良好。三種不同啟動子的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)分離活化的PBMC,其中CD4陽性細胞比例均為30％左右,GFP陽性細胞比例為3％左右。
　　 其次,制備了重組人干擾素慢病毒,測定其轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞后的干擾素表達水平。實驗構(gòu)建了三種不同啟動子的重組IFNα和γ轉(zhuǎn)移質(zhì)粒即pTY-EF1α-IFNγ、pTY-EF1α-IFNα、pTY-CMV-IFNα、pTY-CM

7、V-IFNγ和pFUGW-Ubi-IFNα。高效包裝制備上述5種重組LV-IFN,病毒RNA載量為108-109 copies/ml。SYBRRT-QPCR檢測到LV基因組中的IFNα和INFγ mRNA轉(zhuǎn)錄及整合到293A細胞基因組中的IFNα或γ基因,證實所構(gòu)建的重組LV-IFNα/γ具有感染性。LV-IFNγ轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞12h后,以ELISA方法可以檢測到細胞上清中IFNγ的表達,而LV-IFNα轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞后,上清中檢測不到IFNα的表

8、達。同樣,Wester—blot檢測到293A轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)IFNγ表達,但未檢測到IFNα表達。
　　 最后,實驗研究了重組干擾素慢病毒對腺病毒5型體外復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,4種重組LV-IFNα或IFNγ和腺病毒共感染293A時,各處理組之間腺病毒載量存在顯著差異,F=44.611,P<0.001。經(jīng)檢驗,方差不齊,采用Dunnett T3多重比較法,LV-EF1α-IFNγ、LV-CMV-IFNα、LV-CMV-IFNγ、LV

9、-Ubi—IFNα四種重組LV能顯著抑制腺病毒復(fù)制。從熒光顯微鏡觀察,重組的LV能對細胞起到一定的保護作用,表現(xiàn)為重組LV共感染組293A細胞生長狀態(tài)較好。
　　 本研究成功包裝生產(chǎn)出了高滴度重組LV,揭示不同啟動子驅(qū)動外源基因在不同細胞和組織中的基因調(diào)控能力不同,提示在實際應(yīng)用中,轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的靶細胞,應(yīng)選擇適宜啟動子的重組LV。重組LV轉(zhuǎn)導(dǎo)PBMC效率較低,將進一步研究其因為和提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。實驗建立的高滴度重組LV-IFN系統(tǒng)