腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾體外抑制HBV復(fù)制的研究.pdf

1、目前全世界約有3.5億慢性HBV(hepatits B virus,HBV)感染者,HBV持續(xù)感染是導(dǎo)致慢性肝炎后肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌等疾病的重要原因,嚴(yán)重威脅著人類健康.目前使用的藥物如干擾素、核苷類似物等在治療的有效性、治療后復(fù)發(fā)率等方面尚不理想.RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一項(xiàng)新興的基因沉默技術(shù),是指長21-23bp的雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)誘導(dǎo)序列高

2、度同源的mRNA降解從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象.研究表明,長度在21-23bp的siRNA并不激活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非特異性反應(yīng),使siRNA用于抗HBv治療成為可能.由于RNAi的作用對(duì)象是病毒的mRNA,可針對(duì)HBV基因組的不同保守區(qū)域設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)siRNA,減少病毒通過變異逃避攻擊的可能性,從而彌補(bǔ)核苷類似物類藥物的不足.目前的研究已分別在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)RNAi的抗HBV的作用,使RNAi有望成為抗乙肝病毒治療的新選擇.而將

3、RNAi用于抗HBV的臨床治療,一個(gè)理想的輸送siRNA的載體是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié).近些年分子生物學(xué)迅速發(fā)展,人們對(duì)病毒基因組的結(jié)構(gòu)、功能以及感染機(jī)制的研究不斷深入,病毒載體的構(gòu)建技術(shù)不斷得到改進(jìn)并在基因治療中顯示了良好的應(yīng)用前景.腺病毒是目前基因治療中應(yīng)用最廣的病毒載體之一,作為非整合類病毒,具有感染的宿主范圍廣,外源基因表達(dá)水平高,在受染細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生整合,沒有致癌和致突變的危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn),在應(yīng)用RNAi治療疾病的研究中倍受關(guān)注.本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)

4、建同時(shí)表達(dá)GFP和shRNA的重組腺病毒載體,體外感染具有HBV持續(xù)復(fù)制和病毒蛋白表達(dá)能力的HepG2.2.15細(xì)胞,觀察其對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果,驗(yàn)證腺病毒載體輸送的shRNA抑制HBV復(fù)制的有效性并為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ),研究和評(píng)價(jià)該重組腺病毒對(duì)HBV持續(xù)感染的可能治療作用和應(yīng)用前景,旨在發(fā)現(xiàn)一種更具備臨床治療可用性的載體. 1、重組穿梭質(zhì)粒pShuttle+GFP+shDNA的構(gòu)建 利用BglII和BamHI

5、雙酶切后重新連接獲得不含HindIII酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒pEGFP-C切,設(shè)計(jì)兩端含HindIII和BglII酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增包括CMV啟動(dòng)子的綠熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)框.PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后與載體質(zhì)粒pShuttle連接,通過特異性PCR反應(yīng)、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞等方法篩選和鑒定有效克隆,獲得重組質(zhì)粒pShuttle+GFP.再設(shè)計(jì)一引物從質(zhì)粒pAV6擴(kuò)增含U6啟動(dòng)子的針對(duì)HBV S基

6、因579-597位的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達(dá)框,經(jīng)酶切純化后克隆至pShuttle+GFP載體,特異性PCR反應(yīng)、測序鑒定獲得重組質(zhì)粒pShuttle+GFP+shDNA. 2、重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定 將質(zhì)粒pShtattle+GFP+shDNA用PmeI酶切純化后,取線性化質(zhì)粒50-100ng,在200Ω,2.5KV,25μF條件下電轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)細(xì)菌,菌液在卡那

7、抗性的平板培養(yǎng)過夜,次同挑取中、小克隆搖菌,抽提質(zhì)粒,用PacI酶酶切鑒定陽性克隆后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌,以獲得產(chǎn)量更多的重組腺病毒質(zhì)粒. 3、重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增與病毒滴度測定 取5ug用PmeI酶切后的線性質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,待細(xì)胞基本全部出現(xiàn)病變效應(yīng)后收集細(xì)胞.收集到的細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液再次感染HEK293細(xì)胞,待3-5天細(xì)胞全部出現(xiàn)病變效應(yīng)后收集到更多的病毒液.以不同比例稀釋細(xì)胞裂解液,

8、分別感染HEK293細(xì)胞,30小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量,估計(jì)病毒滴度. 4、不同MOI重組腺病毒對(duì)RNAi效果的影響 在24孔培養(yǎng)板中接種HepG2.2.15細(xì)胞,培養(yǎng)24-48h,待細(xì)胞達(dá)40-50﹪融合率后,分別按MOI為80,160的重組腺病毒量感染細(xì)胞.第2,5,8,11天收集細(xì)胞上清進(jìn)行HBsAg和HBeAg的放射免疫法檢測和HBV DNA的熒光定量PCR的檢測;第2天收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀GF

9、P表達(dá)細(xì)胞數(shù)的檢測:第4天收集細(xì)胞進(jìn)行HBV RNA的檢測. 5、HepG2.2.15細(xì)胞上清HBsAg和HBeAg的檢測 MOI為80,160的重組腺病毒量感染細(xì)胞后,上清檢測顯示HBsAg和HBeAg的分泌作用組均較相應(yīng)對(duì)照組下降,這種下降作用在第8天達(dá)到高峰,HBsAg和HBeAg的抑制率分別為64﹪(MOI=80),92﹪(MOI=160)和39﹪(MOI=80),61﹪(MOI=160).抑制作用一直持續(xù)到11

10、天.上述結(jié)果表明AD-GFP-ShDNA抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg. 6、HepG2.2.15細(xì)胞中HBV RNA的檢測 感染后第4天,收集細(xì)胞抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板,設(shè)計(jì)HBc基因區(qū)引物擴(kuò)增目的基因,同時(shí).以β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,各取等量PCR產(chǎn)物電泳,結(jié)果顯示作用組目的基因條帶弱于對(duì)照組,顯示HBVRNA被腺病毒輸送的shRNA抑制. 7、

11、HepG2.2.15細(xì)胞上清HBV DNA的檢測 收集病毒感染2d,5d,8d,11d的細(xì)胞培養(yǎng)上清,提取HBV DNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBV DNA拷貝數(shù).對(duì)照組AD.GFP組與作用組AD-GFP-shDNA組在感染后HBV DNA拷貝數(shù)均逐漸上升至11天達(dá)到高峰,但作用組AD-GFP-shDNA組在感染5天后HBV DNA載量的上升趨勢明顯弱于對(duì)照AD-GFP組,兩者的差距在第11天達(dá)到最大.結(jié)果顯示腺病毒載體輸送的