重組質(zhì)粒載體和禽腺聯(lián)病毒介導(dǎo)的miRNA抑制IBDV復(fù)制研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種雞的高度接觸性傳染病，除引起雞死亡和生產(chǎn)性能下降，還可導(dǎo)致感染雞的免疫抑制和其它疫苗接種的免疫失敗。IBD呈世界范圍流行，尤其是近年來超強毒株和抗原變異株的出現(xiàn)，使得常規(guī)疫苗的免疫效果明顯下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成的危害越來越大，迫切需要更為有效的新型防制措施。

2、 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來快速發(fā)展的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，在功能基因組研究、腫瘤治療和抗病毒感染等方面具有良好的應(yīng)用前景，已被證明能抑制幾乎所有種屬病毒的復(fù)制。為探索用RNAi技術(shù)抑制IBDV復(fù)制的可行性，本研究在比較不同來源RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄活性基礎(chǔ)上，選用禽源U6啟動子構(gòu)建短干擾RNA(short interference RNA，siRNA)表達(dá)載體，以綠色熒光蛋白(green

3、fluorescent protein，GFP)基因為報告基因，證明在禽源細(xì)胞中能成功實現(xiàn)特異基因表達(dá)沉默；進(jìn)而用專業(yè)軟件預(yù)測IBDV VP2基因特異性siRNlA，將人工合成的微小RNA(microRNA，miRNA)插入表達(dá)載體，以細(xì)胞轉(zhuǎn)染法篩選出2個有效抑制IBDV VP2基因表達(dá)的miRNA，將其克隆入含neo基因的表達(dá)載體，經(jīng)G418篩選獲得抗性細(xì)胞克隆，用感染試驗證明能顯著抑制IBDV復(fù)制；最后將miRNA表達(dá)盒插入禽腺聯(lián)病

4、毒(avian adeno-associated vires，AAAV)轉(zhuǎn)移載體，用重組病毒感染細(xì)胞進(jìn)行的試驗結(jié)果證明，表達(dá)的miRNA對IBDV復(fù)制不僅具有更為顯著的抑制作用，而且對異源毒株復(fù)制也有類似的抑制效果，為IBD防制研究開辟了新的途徑，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。 目前siRNA表達(dá)試驗多用人或鼠源H1或U6啟動子在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行，對于這些啟動子能否在禽細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,s

5、hRNA)或miRNA仍有爭議。我們利用siDirect軟件預(yù)測GFP基因特異性siRNA，將人工合成的相應(yīng)shRNA插入含人H1啟動子的pSuper載體，獲得重組載體pSupcr-shRNA;再將shRNA表達(dá)盒插入含GFP基因的pEGFP-N1載體，獲得重組載體pGFP-H1-shRNA。分別以pEGFP-N1、pSuper-shRNA+pEGFP-N1和pGFP-H1-shRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物源COS-1、293-T細(xì)胞和禽源雞胚肝

6、(CEL)、雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞，根據(jù)相同條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)中熒光陽性細(xì)胞數(shù)及熒光強度的變化，比較人H1啟動子在哺乳動物源和禽源細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄shRNA的效率。結(jié)果顯示，人H1啟動子在哺乳動物細(xì)胞中能有效轉(zhuǎn)錄shRNA，但在禽源細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄效率很低。這些試驗結(jié)果表明，開展禽源細(xì)胞siRNA表達(dá)研究應(yīng)選用禽源啟動子。為了開展禽源細(xì)胞RNAi研究，以含雞U6啟動子的pRFPRNAiC為miRNA表達(dá)載體，用Genscript軟件預(yù)測GFP序

7、列特異性siRNA，從10個潛在的siRNA中隨機選擇1個siRNA序列，用PCR合成雙鏈寡核苷酸，將其插入表達(dá)載體pRFPRNAiC，用獲得的重組載體pRFPRNAiGFP與報告質(zhì)粒pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染COS-1、293-T、CEL和CEF細(xì)胞，根據(jù)相同條件下GFP陽性細(xì)胞數(shù)及熒光強度變化，比較哺乳動物和禽細(xì)胞中雞U6啟動子表達(dá)miRNA的效率。結(jié)果顯示，pRFPRNAiGFP在哺乳動物和禽源細(xì)胞中都能表達(dá)抑制性miRNA，在禽源細(xì)

8、胞中轉(zhuǎn)錄效率較高。這些試驗結(jié)果表明，源禽U6啟動子轉(zhuǎn)錄miRNA的細(xì)胞種屬特異性相對較弱，pRFPRNAiC載體可用于禽源細(xì)胞的miRNA表達(dá)研究。 為了探索用RNAi技術(shù)抑制IBDV復(fù)制的可行性，利用Genscript軟件預(yù)測針對IBDV VP2基因的siRNA，從1O個潛在的siRNA中選擇5個siRNA序列，將PCR產(chǎn)生的雙鏈寡核苷酸插入pRFPRNAiC載體，獲得重組載體pRFPRNAmiVP2A，pRFPRNAmiVP

9、2B，pRFPRNAmiVP2C，pRFPRNAmiVP2D、pRFPRNAmiVP2E；根據(jù)IBDV Lukert株VP2基因序列設(shè)計引物，用PCR擴增不含自身翻譯終止碼的VP2基因，將擴增產(chǎn)物與pEGFP-N1載體中GFP基因的N端融合，獲得報告載體pVP2-GFP。分別將5個miRNA表達(dá)載體與報告載體共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24 h用Northern Dot Blotting確認(rèn)miRNA表達(dá)，然后分別用熒光共聚焦顯微鏡和流

10、式細(xì)胞術(shù)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)中的熒光陽性細(xì)胞數(shù)及熒光總量進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果與報告載體單獨轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，5個miRNA表達(dá)載體與報告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光抑制效率在59.7％-78.5％之間；將抑制效果較好的miVP2A和miVP2E表達(dá)盒分別克隆入含neo基因的pTarget載體，用獲得的重組載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得抗性細(xì)胞，用IBDV Lurket感染，感染三天后用半定量RT-PCR測定VP2基因表達(dá)，并測定IBDV半

11、數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID50)。結(jié)果顯示，miVP2A和miVP2E表達(dá)細(xì)胞中VP2基因表達(dá)抑制率分別為80.7％和75.0％，TCID50分別下降6和5lgs。這些試驗結(jié)果表明，針對VP2基因的兩個miRNA對IBDV基因表達(dá)和復(fù)制均有顯著的抑制作用。利用重組AAAV穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特點，用限制酶消化法去除含AAAV全基因組質(zhì)粒載體pCR-AAAV中的Rep和Cap蛋白編碼序列，獲得AAAV轉(zhuǎn)移載體pAITR：分別將miVP2E

12、和針對VP1基因的miVP1表達(dá)盒連同紅色熒光蛋白(redfluorescent protein，RFP)基因表達(dá)盒插入pAITR中左、右ITR之間，分別用獲得的重組載體pAITR-RFP-miVP2E和pAITR-RFP-miVP1與AAAV包裝載體pcDNA-ARC及腺病毒輔助載體pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，經(jīng)PCR檢測證明獲得的rAAAV中含有miRNA表達(dá)盒，純化rAAAV感染性滴度為8×108TU／ml：用rAAA

13、V轉(zhuǎn)導(dǎo)DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后48 h用3株IBDV感染，感染后不同時間用TCID50測定法檢測感染性病毒，用半定量RT-PCR檢測病毒基因表達(dá)，。結(jié)果顯示，在IBDV Lukert株感染后96 h，miVP2E和miVP1表達(dá)細(xì)胞中VP2基因表達(dá)抑制率分別為85.2％和89.6％，TCID50分別下降6和7lgs；用另兩株IBDV感染miVP2E和miVP1表達(dá)細(xì)胞，感染性病毒測定結(jié)果顯示，miVP2E表達(dá)細(xì)胞中2株IBDV的TCID50