商陸抗病毒蛋白抑制HBV復(fù)制的研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分、全長及不同片段缺失型PAP基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：構(gòu)建全長和不同片段缺失型PAP基因的真核表達質(zhì)粒，為研究PAP抗HBV的活性區(qū)域奠定基礎(chǔ)。 方法：以含全長PAP基因的質(zhì)粒PGEM-PAP為模板，設(shè)計3對引物，PCR擴增全長及不同片段缺失型PAP基因，TA克隆到pMD18-T 載體中，經(jīng)PCR、酶切、測序確證后，將它們用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，以正確讀碼框插入到經(jīng)同樣酶

2、切的帶有HA標(biāo)簽的真核表達載體pXF3H中，獲得真核表達質(zhì)粒pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34。以PCR和酶切方法篩選鑒定陽性重組質(zhì)粒并測序驗證。 結(jié)果：構(gòu)建的全長及不同片段缺失型PAP基因的真核表達質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和DNA測序，表明各基因正確地插入到真核表達載體pXF3H中，且密碼子閱讀框正確。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了全長和不同片段缺失型PAP基因的真核表達質(zhì)粒。 第二部分、全長P

3、AP基因真核表達質(zhì)粒體外抑制HBV復(fù)制的研究 目的：了解全長PAP基因真核表達質(zhì)粒在DNA水平、RNA水平、蛋白質(zhì)水平體外對HBV的抑制作用。 方法：利用脂質(zhì)體將全長PAP基因真核表達質(zhì)粒pXF3H-PAP12和具有復(fù)制能力的1.3倍HBV克隆pHBV1.3共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染72h后收集細胞及培養(yǎng)上清。Southern blot檢測HBV核衣殼相關(guān)DNA含量，Northern blot檢測HBV核衣殼相關(guān)RNA含

4、量，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液HBsAg和HBeAg含量。 結(jié)果：與pXF3H空載體對照組相比，0.5ug/ml、1.0ug/ml pXF3H-PAP12質(zhì)粒對HBV核衣殼相關(guān)DNA的抑制率分別為38.0％（P﹤0.01）、74.0％（P﹤0.01）；對HBsAg的抑制率分別為76.8％（P﹤0.01）、99.7％（P﹤0.01），對HBeAg的抑制率分別為72.7％（P﹤0.01）、99.3％（P﹤0.01）；1.0ug/m

5、l pXF3H-PAP質(zhì)粒對HBV核衣殼相關(guān)RNA的抑制率為69.0％（P﹤0.01）。 結(jié)論：全長PAP基因真核表達質(zhì)粒pXF3H-PAP12體外對HBV的病毒復(fù)制（DNA水平）和基因表達（RNA水平、蛋白質(zhì)水平）均有抑制作用。 第三部分、天然PAP體內(nèi)抑制HBV復(fù)制的研究 目的：探討天然PAP在急性HBV感染小鼠模型體內(nèi)抗HBV的效果。 方法：以液壓法將具有復(fù)制能力的HBV質(zhì)粒pAAV-HBV1.2通

6、過尾靜脈注射到免疫功能正常的BAL B/C小鼠體內(nèi)，以建立急性HBV感染的小鼠模型。注射后第1天ELISA檢測小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平，根據(jù)HBsAg和HBeAg水平將35只小鼠配對，分成PAP治療組和對照組（每組12只）。PAP治療組予0.25mg/kg的PAP（對照組予生理鹽水）腹腔注射，每日一次，連續(xù)7天。于PAP注射前、注射第1、3、5、7天后，ELISA檢測小鼠血清中HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗Hbe水平，

7、熒光定量PCR檢測小鼠血清中HBV DNA水平。注射第7天后HE染色檢測肝組織病理變化，免疫組化檢測肝組織HBsAg和HBcAg表達情況。 結(jié)果：35只小鼠注射pAAV-HBV1.2后，有30只（85.7％）小鼠在注射后第1天血清中可檢測到HBsAg，另5只小鼠血清中始終未檢測到HBsAg。小鼠血清中HBsAg和HBeAg在第1天表達達高峰，之后逐漸下降，第8天均未能檢測到。小鼠血清中HBV DNA在第2天達高峰，之后仍維持在較

8、高水平，至第8天時為1.9×104 copies/mL。與腹腔注射生理鹽水組相比，PAP在腹腔注射后第1、3、5天對HBsAg的抑制率分別為23％（P﹤0.05）、47％（P﹤0.05）、68％（P﹤0.05），對HBeAg的抑制率分別為36％（P﹤0.05）、55％（P﹤0.05）、83％（P﹤0.05）；PAP在腹腔注射后第1、3、5、7天對HBV DNA的抑制率分別為70.7％（P﹤0.05）、86.9％（P﹤0.05）、95.2

9、％（P﹤0.05）、95.3％（P﹤0.05），PAP也能抑制肝組織HBsAg和HBcAg的表達。 結(jié)論：0.25mg/kg劑量的天然PAP在急性HBV感染小鼠模型體內(nèi)對血清和肝組織的HBsAg、HBeAg的表達及HBV DNA的復(fù)制均有明顯的抑制效果。 第四部分、全長及不同片段缺失型PAP基因真核表達質(zhì)粒體外抗HBV的研究 目的：比較全長和不同片段缺失型PAP基因真核表達質(zhì)粒體外抗HBV作用及其細胞毒作用。

10、 方法：將全長PAP基因、缺失C端25個氨基酸的PAP基因、既缺失N端69個氨基酸又缺失C端25個氨基酸的PAP基因的真核表達質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2 2.2.15細胞，轉(zhuǎn)染72h后收集細胞及培養(yǎng)上清。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液HBsAg和HBeAg水平，熒光定量PCR檢測培養(yǎng)上清HBV DNA水平，MTT比色法檢測各質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染的HepG2細胞毒性作用。 結(jié)果：與pXF3H空載體對照組相比，2.0μg/ml pXF3H-

11、PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34質(zhì)粒對HBsAg的抑制率分別為61.39％（P﹤0.05）、56.3％（P﹤0.05）、7.8％（P﹥0.05），對HBeAg的抑制率分別為84.2％（P﹤0.05）、75.8％（P﹤0.05）、11.0％（P﹥0.05）；對HBV DNA的抑制率分別為63.2％（P﹤0.05）、61.7％（P﹤0.05）、20.5％（P﹤0.05）；MTT結(jié)果顯示它們對細胞的抑制率分別為28.