繁縷抗病毒活性蛋白的初步研究.pdf

1、繁縷(Stellaria media(L.) Villars)為石竹科(Caryophyllaceae)繁縷屬(Stellar iaL.)植物，是一種藥食同源植物。繁縷全草入藥，有多種藥用功效，尤其繁縷鮮汁液在治療皰疹等病毒性皮膚病方面有顯著療效。為闡明其藥效物質，本研究以抗單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)的活性為導向，從繁縷中分離純化得到一種新的抗HSV-2活性蛋白，初步對其進行了理化性質、質譜和生物活性研究，發(fā)現(xiàn)其具有過氧化物酶(PO

2、D)和核糖體失活蛋白(RIP)的相關活性；本文同時對繁縷RIP基因的克隆和表達展開研究，首次克隆到Q1、Q2兩個繁縷RIP基因并獲得異源表達，為繁縷抗病毒藥效物質的分離純化和闡明提供了關鍵信息。主要研究結果如下：
　　 1繁縷活性蛋白分離純化、結構及生物活性研究
　　 1.1繁縷活性蛋白分離純化
　　 以抗病毒(HSV-2)活性為導向分離指標，采用50％-85％飽和度硫酸銨鹽析、弱陽離子交換柱層析、葡聚糖凝膠柱層

3、析及強陽離子交換柱層析技術，從繁縷中分離得到一種抗病毒活性蛋白。SDS-PAGE、FPLC、MALDI-TOFMS顯示該蛋白達到色譜純以上，精確分子量為35.157kD;PAS染色結果表明該蛋白是糖蛋白；IEF-PAGE電泳結果表明為堿性蛋白，等電點9.3＜pI＜9.6.
　　 1.2繁縷活性蛋白鑒定
　　 對分離得到的活性蛋白，應用MALDI-TOF MS進行肽指紋圖譜分析，數(shù)據庫檢索未能發(fā)現(xiàn)與之匹配的數(shù)據。應用ESI

4、-Q-TOF2 MS解析了活性蛋白的4個胰酶水解肽段的氨基酸序列，分別為GFEVIDAAK(Fr1)、GPSFAVQLR(Fr2)、AFSTNKGLAPGLLR(Fr3)和MGNTGVLTGERNDR(Fr4).數(shù)據庫檢索和比對結果顯示獲得的序列為蛋白新序列.多重序列比對結果表明其中Fr1和Fr4肽段與植物POD的部分氨基酸保守序列同源性較高。鑒定該蛋白是一種新的天然植物蛋白，命名為SAP(Stellaria Antiviral Pro

5、tein)。
　　 1.3繁縷活性蛋白生物活性研究
　　 實驗表明SAP具有抗病毒、抗腫瘤活性。體外抗病毒實驗顯示SAP可體外抑制HSV-2對細胞的感染，IC50達到0.37μM,CC50大于40μM。其在HSV-2感染初期作用效果最顯著，作用機制與直接使病毒失活有關。體外抗腫瘤實驗顯示SAP有較強的抗人早幼粒白血病細胞HL-60和人結腸癌細胞LoVo生長活性，IC50分別為9.09μM和12.32μM，同時對正常細胞生

6、長無明顯作用，CC50大于40μM,具有顯著地選擇性抑制腫瘤細胞增殖作用.
　　 SAP具有較強的RNAN-糖苷酶活性和DNA超螺旋裂解活性。SAP對核糖體RNA和超螺旋DNA的這種切割作用具有不可修復性，可以稱之為DNA（RNA）糖苷酶/脫嘌呤裂解酶，這種酶活性也許是SAP抗病毒、抗腫瘤的主要作用機制之一.體外POD活性實驗表明SAP還具有較強的POD活性，酶活力大小為36.6Umin－1μg－1，Km值為0.01mol/L.

7、
　　 2繁縷核糖體失活蛋白（RIP）基因的克隆及其原核表達研究
　　 2.1繁縷RIP基因克隆及序列分析
　　 采用同源克隆的方法，獲得繁縷RIP基因保守區(qū)片段，結合RACE技術獲得5’和3’非翻譯區(qū)序列，將相關序列拼接，獲得了2條繁縷RIP基因Q1(FJ860049)和Q2(FJ860050)的cDNA全長。Q1與Q2的開放閱讀框（ORF）分別為858bp,765bp，其同源性為95.5％.Q1、Q2有390

8、個堿基與同科其他植物RIP基因完全相同，且堿基的分布具有一定的規(guī)律性，但與不同科屬植物RIP同源性較低.Q1、Q2和以DNA為模板獲得的繁縷RIP基因Q(FJ860051)進行分析比較，證實繁縷RIP基因無內含子。
　　 Q1和Q2編碼的繁縷RIP分別命名為Stellarin1和Stellarin2.二者的理論分子量分別為31.0kD和27.6kD,pI分別為9.40和9.54，都包含由23個氨基酸組成的信號肽。其理化特征均與Ⅰ

9、型RIP和SAP相似，但與后者的同源性較低。序列分析發(fā)現(xiàn)，Stellarin1和Stellarin2與已知RIP產生抗病毒活性的特征區(qū)域同源性很高，相應保守區(qū)域完全相同，表明繁縷RIP具備抗病毒能力，預示繁縷存在多種抗病毒活性蛋白.
　　 2.2繁縷RIP基因原核表達
　　 將Q1、Q2連接到載體，獲得重組質粒pET29a-Q1和pET29a-Q2，將其轉化到大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)和BL21(DE3)ply