靶向HBV的高效siRNA的篩選及體內(nèi)、外抗病毒研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一，嚴重危害人類健康。盡管預防疫苗免疫降低了乙肝發(fā)生率，但目前全世界仍有約4億HBV感染者，當前的藥物治療方法尚不足于應對該挑戰(zhàn)，因此迫切需要發(fā)展新的更為有效的治療手段以對付HBV的威脅。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)序列特異性抑制基因表達的機制，將RNAi技術應用于包括病毒性肝炎等在內(nèi)的疾病治療己成為當前的研究熱點，而獲得兼具高效抑制特性和保守性特征的RNAi靶位是RNAi治療方法

2、獲得成功應用的重要基礎。本研究以生物信息學為輔助，通過建立多基因型HBV細胞和小動物表達模型，對HBV基因組上潛在的siRNA靶點進行了規(guī)?；Y選和驗證，獲得多個具有良好應用潛力的siRNA靶點，為進一步應用RNAi技術開發(fā)新型乙肝治療方法提供重要基礎。 本研究首先通過Genbank數(shù)據(jù)庫獲得623個已報道的HBV全基因組序列，應用GCG生物信息學工作站對其進行全基因組的序列保守性分析，獲得同源性為95％以上的高保守序列區(qū)段。采

3、用步移法設計可靶向上述高保守序列區(qū)段的siRNA，并通過RNAi脫靶效應分析軟件進行分析，初篩獲得40個可識別不同位點并具有高保守特征的候選siRNA靶點序列，并以pSUPER為載體分別構建了相應的shRNA表達質(zhì)粒，用于進行進一步的篩選實驗。本研究采用與HBV1.3倍體克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實驗檢測不同siRNA對HBV的抑制效率。應用本實驗室構建的5個分屬Cl、Dl、Ae基因型的HBV1.3倍體克隆在Huh-7細胞中建立了體外HBV瞬時表

4、達模型，結果顯示其均可有效在Huh-7細胞中表達HBV重要標志性抗原HBsAg與HBeAg。同時通過對檢測時間點與共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用量配比的比較分析，確定了較有利于篩選高效靶點的檢測條件。在此基礎上，將本研究構建的40個包含候選siRNA表達元件的質(zhì)?？寺》謩e與上述HBV1.3倍體克隆以1：10的用量比例對Huh-7細胞進行共轉(zhuǎn)染實驗，檢測不同靶點siRNA對HBV蛋白表達的抑制能力。結果顯示，本研究選擇設計的40個siRNA可在不同程度上抑

5、制HBV的表達，其中部分靶點的siRNA體現(xiàn)出良好的抑制效果(部分靶點已申請發(fā)明專利，申請?zhí)枺?00810110686.4)。本研究選擇了其中3個抑制效率較好的siRNA靶點(B244、B245、B376)用于進一步的研究和驗證。通過CCK8檢測細胞毒性與細胞活力，和干擾素相關基因STAT-1及OSA-1表達水平檢測顯示上述3個靶點siRNA在細胞中的表達不會引起的細胞活性及干擾素相關基因基因轉(zhuǎn)錄水平的異常變化，顯示其無脫靶效應。

6、 RNAi技術應用于抗病毒治療研究中另一重要方面是如何有效地將siRNA或siRNA表達元件導入靶細胞中。應用HBV表達細胞株HepG2—N10，本研究探討了通過重組慢病毒載體和化學修飾siRNA的方式導入siRNA抑制HBV表達的可行性。本研究分別構建了可表達靶向B1579、B1881、B2391、B2393的siRNA的重組慢病毒，轉(zhuǎn)導HBV表達細胞株HepG2—N10后檢測結果顯示可顯著抑制HBV的表達。本研究同時合成了可靶向

7、B244、B376的siRNA，以及針對同樣靶點的分別經(jīng)5’端甲氧基修飾、磷酸化修飾和固醇修飾的siRNA，對HepG2—N10細胞的轉(zhuǎn)染實驗結果顯示，化學合成的siRNA均能有效下調(diào)HepG2—N10細胞HBV蛋白的表達，其中經(jīng)修飾后的siRNA可表現(xiàn)出更好的抑制效果。 為進一步驗證本研究獲得的siRNA在動物模型體內(nèi)對HBV表達的抑制效果，本研究應用尾靜脈高壓注射法和不同基因型的HBV1.3倍體克隆建立了HBV小鼠模型。通過