庚型肝炎病毒作為復(fù)制型基因治療載體及小干擾RNA對(duì)病毒表達(dá)復(fù)制抑制作用的研究.pdf

1、第一部分,HGV作為復(fù)制型基因治療載體的實(shí)驗(yàn)研究.庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)是單正鏈的RNA病毒,長(zhǎng)約9.4Kb,含一個(gè)開(kāi)放讀碼框架,編碼2900左右的氨基酸.病毒具有細(xì)胞親嗜性,分別存在著淋巴細(xì)胞和肝細(xì)胞親嗜株,該室建立的HGV克隆株經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可能是肝細(xì)胞親嗜性的.HGV與HCV同屬于黃病毒家族,其基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制機(jī)理也非常相似.用外源基因neo代替HCV的結(jié)構(gòu)基因區(qū),并插入ECMVIRES直接翻

2、譯HCV的非結(jié)構(gòu)基因區(qū),由此建立的HCV亞基因組復(fù)制子能夠在體外培養(yǎng)細(xì)胞中自主持久復(fù)制和表達(dá).因此,我們嘗試將HGV基因組進(jìn)行適當(dāng)改造,用外源報(bào)告基因或治療基因代替HGV的結(jié)構(gòu)基因,并插入篩選標(biāo)志抗性基因neo,兩者間直接用ECMVIRES連接,保留HGV的非結(jié)構(gòu)基因,由此建立HGV亞基因組復(fù)制子,研究其在穩(wěn)定表達(dá)HGV結(jié)構(gòu)蛋白的體外培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制、表達(dá)和病毒的包裝,探索將病毒構(gòu)建成能自主復(fù)制并且具有肝組織靶向性的一類(lèi)新型載體,以期用

3、于肝病的基因治療.第二部分,小干擾RNA對(duì)庚型肝炎病毒表達(dá)復(fù)制抑制作用的研究.RNA干擾(RNAi)是由小干擾RNA(siRNA)引發(fā)的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,是近年來(lái)興起的一項(xiàng)研究生物基因調(diào)控與功能的嶄新技術(shù),是機(jī)體抵御外在感染的一種重要保護(hù)機(jī)制,是一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的遺傳工具.其本質(zhì)是siRNA與其對(duì)應(yīng)的靶mRNA特異結(jié)合,降解靶RNA從而阻止其轉(zhuǎn)錄后的翻譯.siRNA是雙鏈RNA(double-stran

4、d RNA,dsRNA)被RNase Ⅲ家族中的核酸酶Dicer降解后產(chǎn)生的長(zhǎng)21-23個(gè)核苷酸(nucleotide,nt)的小片段,具有5′-磷酸、3′-羥基和1-2nt的3′-粘性末端.該課題設(shè)計(jì)了靶向HGV E2區(qū)的兩對(duì)siRNA,研究siRNA對(duì)HGV病毒RNA合成和基因表達(dá)的抑制作用,探討RNAi在阻斷病毒復(fù)制方面的應(yīng)用.實(shí)驗(yàn)還同時(shí)設(shè)計(jì)了靶向報(bào)告基因EGFP的一個(gè)已知有效的siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照,設(shè)計(jì)一個(gè)與人、小鼠、大鼠等基

5、因無(wú)任何同源性的無(wú)關(guān)siRNA作為陰性對(duì)照.綜上所述,該研究中采用全長(zhǎng)HGV結(jié)構(gòu)基因包括5′N(xiāo)TR區(qū)構(gòu)建了表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞證實(shí)其能成功表達(dá)和剪切、修飾,提示建立的HuhEH細(xì)胞株可能可以作為HGV基因治療載體的包裝細(xì)胞.構(gòu)建了同時(shí)帶有報(bào)告基因與篩選基因或是治療基因與篩選基因的HGV亞基因組復(fù)制子,并在體外培養(yǎng)細(xì)胞Huh7中證實(shí)此復(fù)制子是能夠自主持久表達(dá)和復(fù)制的,并在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到了HGV復(fù)制子RNA的存在,電鏡下檢測(cè)到了可疑