RNA干擾抑制乙型肝炎病毒復制與表達及其機制研究.pdf

1、目的：觀察RNA干擾技術在抑制乙型肝炎病毒(HBV)復制與表達方面的作用，同時，對Dicer基因在RNA干擾產(chǎn)生機制中的作用進行探討。 方法：(1)將13倍HBV基因克隆入pCDNA3．1中，構建HBV真核表達載體pHBV，將其轉染肝癌細胞HepG2，建立HBV瞬時表達模型，并通過ELISA、免疫熒光、Southern和Northernblot檢測對該模型進行評價；(2)針對乙型肝炎病毒的四個開發(fā)放性讀碼框，設計并構建十種shR

2、NA表達載體pShRNA；將pHBV和pShRNA共轉染入肝癌細胞，通過ELISA、免疫熒光、Southern、Northern、Westernblot和RT-PCR檢測，觀察HBV復制與表達受抑制的情況。(3)設計并構建兩種針對Dicer基因中RNA酶III結構域的shRNA表達載體，即pShRNA-D1和pShRNA-D2，先將其轉染HepG22．2．15細胞和結腸癌細胞，通過RT-PCR檢測，觀察Dicer基因受抑的情況。將pSh

3、RNA-Dl轉染整合了綠色熒光蛋白(GFP)基因的HepG2A9細胞，以抑制其Dicer基因的表達，再轉染抗GFP的shRNA表達載體，觀察Dicer受抑制后，是否影響后續(xù)shRNA表達載體的功能發(fā)揮，以此反映Dicer酶在RNA干擾產(chǎn)生機制中的作用。 結果：(1)成功構建了HBV真核表達載體pHBV，通過ELISA、免疫熒光、Southem和Northemblot能檢測到HBV的復制與表達，說明通過轉染pHBV可以建立HBV瞬

4、時感染模型。(2)成功構建了十種針對HBV的shRNA表達載體，通過ELISA、免疫熒光、Southern、Northern、Westemblot及RT-PCR等，觀察到HBV復制與表達均受到明顯抑制，說明RNA干擾可以有效抑制HBV的復制與表達。(3)成功構建了兩種針對Dicer基因中RNA酶III結構域的shRNA表達載體，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在三個細胞系中，Dicer基因的表達均受到明顯抑制，說明通過載體表達shRNA的方式