人APOBEC3G抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、本研究組建立了APOBEC3G穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，觀察APOBEC3G抑制HBV復(fù)制過程中參與的信號(hào)通路及細(xì)胞因子；我們用熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)及表面離子共振實(shí)驗(yàn)(SPR)檢查APOBEC3G與HBV核心抗原(HBc)之間是否有結(jié)合，并且觀察RNA對(duì)它們之間相互作用的關(guān)系的影響；同時(shí)我們構(gòu)建APOBEC3G不同突變體，觀察它們對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用并研究它們與HBc的關(guān)系。因此本研究共分為三個(gè)部分。
　　 第一部分：NF-

2、кB參與人APOBEC3G抗HBV過程之中
　　 研究目的：
　　 證實(shí)APOBEC3G能抑制HBV DNA復(fù)制和蛋白表達(dá)，建立穩(wěn)定過表達(dá)APOBEC3G的細(xì)胞株，觀察是NF-кB否參與APOBEC3G抗病毒過程中，探討APOBEC3G抗病毒機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 轉(zhuǎn)染APOBEC3G到HepG2細(xì)胞以建立穩(wěn)定過表達(dá)APOBEC3G的細(xì)胞株，用PCR及western驗(yàn)證細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，同時(shí)轉(zhuǎn)染

3、pcDNA3.1(-)-myc-his作為對(duì)照；用RT-CES系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞的生長狀態(tài)；轉(zhuǎn)染pEGFPN-1到構(gòu)建成功的細(xì)胞株中，用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測過表達(dá)APOBEC3G是否影響細(xì)胞接受外來質(zhì)粒的能力；轉(zhuǎn)染1.3拷貝的HBV質(zhì)粒，用熒光定量PCR檢測細(xì)胞中HBVDNA水平，用放射免疫法檢測上清中HBs Ag及Hbe Ag的表達(dá)量的變化；將pNF-кB-Luc質(zhì)粒單獨(dú)或與1.3拷貝的HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到構(gòu)建成功的細(xì)胞后，檢測熒光

4、素酶活性；轉(zhuǎn)染1.3拷貝的HBV質(zhì)粒到構(gòu)建成功的細(xì)胞后，用含有IKKβ抑制劑(IMD-0354)的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，熒光定量PCR測HBVDNA水平的變化；設(shè)計(jì)引物，用相對(duì)熒光定量PCR檢測成功構(gòu)建的細(xì)胞株中IL-6、IL-8、IL-1β、IL-lα的水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.從RNA及蛋白水平證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)APOBEC3G的HepG2細(xì)胞株構(gòu)建成功；
　　 2.穩(wěn)定過表達(dá)的APOBEC3G能抑制HBV D

5、NA復(fù)制及HBs Ag及Hbe Ag的表達(dá)；
　　 3.APOBEC3G不影響HepG2細(xì)胞的生長，RT-CES系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)APOBEC3G的HepG2細(xì)胞的生長狀態(tài)與對(duì)照沒有差異；
　　 4.APOBEC3G不影響HepG2細(xì)胞接受其他質(zhì)粒，流式結(jié)果顯示過表達(dá)APOBEC3G的HepG2細(xì)胞的pEGFPN-1的轉(zhuǎn)染效率及熒光強(qiáng)度與對(duì)照組沒有差異；用熒光顯微鏡觀察得到同樣結(jié)果；
　　 5.APOBEC3

6、G能激活NF-кB，如果伴隨HBV的感染NF-кB更是被顯著激活；
　　 6.阻斷NF-кB的激活能抑制APOBEC3G抗病毒作用，用含有IKKβ抑制劑(IMD-0354)的培養(yǎng)基培養(yǎng)過表達(dá)APOBEC3G細(xì)胞時(shí)，APOBEC3G對(duì)HBVDNA的抑制效率只有42％，不加IMD-0354時(shí)APOBEC3G對(duì)HBV DNA的抑制達(dá)到90％；
　　 7.APOBEC3G能上調(diào)IL-6、IL-8及IL-1β在HepG2細(xì)胞中的表

7、達(dá)；但對(duì)IL-lα的表達(dá)沒有影響；
　　 研究結(jié)論：
　　 1.APOBEC3G能抑制HBV DNA復(fù)制及HBs Ag及Hbe Ag的表達(dá)；
　　 2.NF-кB參與APOBEC3G對(duì)HBV DNA的抑制過程中；
　　 3.APOBEC3G可能通過激活NF-кB再誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子從而抗病毒。
　　 第二部分：APOBEC3G能直接結(jié)合HBV核心抗原
　　 研究目

8、的：
　　 觀察APOBEC3G與HBV核心抗原(HBc）之間的關(guān)系，了解它們是直接結(jié)合還是需要RNA或其他細(xì)胞成分的介導(dǎo)，探討APOBEC3G抗HBV病毒的作用機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 構(gòu)建pA3G-CFP及pHBc-YFP融合質(zhì)粒，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察pA3G-CFP和pHBc-YFP在HepG2細(xì)胞中的定位；共轉(zhuǎn)染pA3G-CFP及pHBc-YFP到HepG2細(xì)胞中，用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET

9、)成像，再計(jì)算FR值，觀察細(xì)胞中APOBEC3G是否能結(jié)合HBc;構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽pA3G-HA及HBc聚集缺陷突變體pHBc-Y132A-HA，表達(dá)并純化APOBEC3G及HBc-Y132A-HA蛋白，用BIAcore3000檢測純的APOBEC3G與HBc-Y132A-HA蛋白是否有相互作用，同時(shí)加入HepG2細(xì)胞RNA及HepG2.2.15細(xì)胞RNA看對(duì)它們的結(jié)合是否有影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建p

10、A3G-CFP、pHBc-YFP、pA3G-HA及pHBc-Y132A-HA等質(zhì)粒；
　　 2.用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到APOBEC3G散點(diǎn)狀分布在胞漿中，而HBc則在胞漿胞核中均有分布，兩個(gè)蛋白在胞漿中有共定位；
　　 3.三通道FRET在FRET通道檢測到APOBEC3G-CFP與HBc-YFP之間有FRET信號(hào)，F(xiàn)R值與陰性對(duì)照組相比有顯著差異；同樣熒光受體漂白實(shí)驗(yàn)也檢測到APOBEC3G-CFP與HBc-YF

11、P之間有FRET信號(hào)；
　　 4.成功獲得APOBEC3G-HA及HBc-Y132A-HA蛋白，BIAcore3000檢測到APOBEC3G-HA與HBc-Y132A-HA之間有SPR信號(hào)；
　　 5.加入HepG2細(xì)胞RNA及HepG2.2.15細(xì)胞RNA后，APOBEC3G-HA與HBc-Y132A-HA之間的SPR信號(hào)沒有顯著改變。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.APOBEC3G與HBc在HepG2細(xì)

12、胞中有相互作用；
　　 2.APOBEC3G能與HBc直接結(jié)合，而不依賴與細(xì)胞中的其他成分，細(xì)胞RNA及病毒RNA對(duì)他們的結(jié)合沒有影響。
　　 第三部分：APOBEC3G不同結(jié)構(gòu)域?qū)BV的抑制作用及機(jī)制研究
　　 研究目標(biāo)：
　　 研究APOBEC3G不同結(jié)構(gòu)域?qū)BV DNA復(fù)制的影響，尋找APOBEC3G對(duì)HBV作用的功能域；尋找APOBEC3G與HBc的結(jié)合域。
　　 研究方法：
　

13、　 構(gòu)建APOBEC3G功能域缺失體pCD1、pCD2和活性中心缺失體pDE12，將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別與1.3拷貝HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到HepG2細(xì)胞中，用熒光定量PCR檢測它們對(duì)HBV DNA的抑制效果；構(gòu)建pCD1、pCD2、pDE12與CFP的融合質(zhì)粒pCDl-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP，將熒光蛋白融合質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CD1、CD2和DE12在細(xì)胞中的分布；將pCDl-CFP、pC

14、D2-CFP，pDE12-CFP分別與pHBc-YFP共轉(zhuǎn)到HepG2細(xì)胞中，用熒光受體漂白實(shí)驗(yàn)觀察它們與HBc的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建APOBEC3G功能域缺失體pCD1、pCD2及pDE12及pCDl-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP;
　　 2.用激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)CD1分布在胞漿中，而CD2在胞漿胞核中都有表達(dá)，DE12則分布在核周的胞漿中，且CD1和DE12有聚集

15、現(xiàn)象；
　　 3.CD1和CD2均能顯著抑制HBV DNA的復(fù)制，且CD2的抑制效果比全長APOBEC3G的抑制效果更顯著，兩個(gè)活性中心都去掉的DE12的抑制作用則相對(duì)較弱；
　　 4.熒光受體漂白實(shí)驗(yàn)檢測到CDl-CFP、CD2-CFP與HBc-YFP之間都有FRET信號(hào)，但是CD2-CFP與HBc-YFP之間的信號(hào)比CDl-CFP與HBc-YFP之間的信號(hào)弱，且都比全長APOBEC3G與HBc之間的信號(hào)弱，DE12-

16、CFP與HBc-YFP之間沒有檢測到FRET信號(hào)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.APOBEC3G的兩個(gè)功能域都能抑制HBV的復(fù)制，這說明APOBEC3G的抑制機(jī)制不是單一的；
　　 2.APOBEC3G的兩個(gè)功能域都能與HBc結(jié)合，但是N端結(jié)構(gòu)是主要結(jié)合域。
　　 全文結(jié)論
　　 1.APOBEC3G能顯著抑制HBV DNA的復(fù)制及蛋白表達(dá)，且NF-кB可能參與APOBEC3G抗HBV過程之中；<