乙型肝炎病毒X基因轉(zhuǎn)化人肝細(xì)胞及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:乙肝病毒(HBV)的慢性感染與肝細(xì)胞癌(HCC)之間存在著密切的關(guān)系，然而HBV誘發(fā)HCC的確切機(jī)制仍不十分清楚。研究表明，乙肝病毒X基因(HBV X)及其編碼的蛋白(HBx)在HCC的發(fā)生中起著重要的作用，但關(guān)于HBx能否直接轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞一直存在著爭(zhēng)議，其原因之一可能是缺乏合適的體外模型。本研究中，選用人源性永生化非瘤性肝細(xì)胞株QSG7701作為靶細(xì)胞，將HBVX導(dǎo)入QSG770l細(xì)胞，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，研究H

2、Bx對(duì)QSG7701細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用及其機(jī)制。 方法:①用PCR擴(kuò)增HBV X基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至真核表達(dá)載體pRc／CMV2，從而構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV／X。②將重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV／X及空載體pRc／CMV2分別轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞，經(jīng)含G418的選擇性培基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。RT-PCR及Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV X mRNA和HBx蛋白的表達(dá)。③Western blot檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒pC

3、MV／X轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(pCMV X／QSG7701)、空載體pRc／CMV2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(pRcCMV2／QSG7701)以及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中c-Myc及Bcl-2蛋白的表達(dá)差異。④用MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算倍增時(shí)間。⑤用流式細(xì)胞技術(shù)分析三組細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期中G1期、S期細(xì)胞分別所占的比例。⑥軟瓊脂克隆形成率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞在軟瓊脂中非錨著依賴性生長(zhǎng)的能力。 結(jié)果:①成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV／X。

4、②RT-PCR及Western blot檢測(cè)顯示pCMV／X轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中有HBV XmRNA及HBx蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。③流式細(xì)胞技術(shù)分析顯示，pCMV X／QSG7701與pRcCMV2／QSG7701以及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞相比，凋亡率增高，細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞數(shù)目所占的比例減少，而S期細(xì)胞數(shù)目所占比例增多。④MTT比色結(jié)果顯示，pCMV X／QSG7701細(xì)胞株的倍增時(shí)間與其他兩組相比明顯縮短(分別為14h，29h

5、，38h)。⑤pCMV／X轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、pRc／CMV2轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞株，軟瓊脂克隆形成率分別為19.83±1.96％，1.76±0.03％，1.33+0.18％，pCMV／X轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的克隆形成率明顯高于后兩組(P_<0.05)。⑥Western blot檢測(cè)表明pCMV／X轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中c-Myc蛋白的表達(dá)水平較其他兩組高，Bcl-2蛋白在三組細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)水平無(wú)明顯差異。 結(jié)論:①本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)

6、建了含有HBV x基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV／X，可于體外研究HBV X基因?qū)φ婧思?xì)胞的影響。②采用人源性正常肝細(xì)胞QSG7701為研究對(duì)象，建立了HBV x穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討HBx在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用，提供了一個(gè)有價(jià)值的細(xì)胞模型。③研究顯示HBx能夠在體外轉(zhuǎn)化正常人肝細(xì)胞QSG7701，使細(xì)胞具有惡性化生長(zhǎng)的傾向。④HBx上調(diào)細(xì)胞中c-Myc蛋白的表達(dá)。值得注意的是，HBV X轉(zhuǎn)染細(xì)胞中：Bcl-2蛋白的