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1、研究背景: 大量研究表明原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC,肝癌)發(fā)生是一個(gè)多基因、多途徑的復(fù)雜多階段過(guò)程,基因的點(diǎn)突變、擴(kuò)增、移位、重排及病毒基因的插入,引發(fā)原癌基因的激活和抑癌基因的失活,是肝癌發(fā)生的核心生物學(xué)過(guò)程。同時(shí),肝癌的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,遺傳決定了個(gè)體遺傳易感性,而環(huán)境因素決定了什么樣的易感個(gè)體患癌。 腫瘤遺傳易感性最明顯的臨床特征是家族史,即在同一個(gè)家族的數(shù)代中,有多位腫瘤患者。遺傳性和散發(fā)性腫瘤都關(guān)
2、系到同一組癌相關(guān)基因,體細(xì)胞癌相關(guān)基因突變及其積累的速度,使具有不同遺傳多態(tài)性的個(gè)體,有不同中、低程度的腫瘤易感性。因此,腫瘤家族的臨床鑒定近年受到重視,癌家族可作為遺傳易感性的一種指標(biāo),同時(shí)還有助于闡明腫瘤病因、臨床處理、遺傳咨詢以及癌相關(guān)基因的鑒定。 流行病學(xué)調(diào)查和遺傳學(xué)研究均顯示:在原發(fā)性肝細(xì)胞癌家系中,乙型肝炎病毒(HBV)感染也呈家庭聚集現(xiàn)象,HBV與肝癌有密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí):HBV DNA編碼的乙肝病毒X蛋白
3、(HBx)在HBV致癌過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。HBx具多項(xiàng)功能,通過(guò)影響Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在肝癌的發(fā)生機(jī)制中起到重要的作用。在肝癌組織中和癌旁組織中有多個(gè)Wnt信號(hào)途徑基因表達(dá)異常、基因突變。 β—catenin基因定位于人染色體3p21-22,基因全長(zhǎng)23.2kb,有16個(gè)外顯子,編碼β—聯(lián)蛋白。β—聯(lián)蛋白是Wnt途徑的決定性成分。β—catenin、軸蛋白(AXIN)基因的突變能阻止β—聯(lián)蛋白的下調(diào),激活Wnt途徑。對(duì)人
4、肝癌組織和癌旁組織的研究可檢測(cè)到β—catenin基因變異且存在于exon3的condons32~45之間。 但是既往研究或僅局限于作HBV、HCC的流行病學(xué)和(或)遺傳病學(xué)調(diào)查分析,或者僅專注于肝癌組織及癌旁肝組織廣泛基因篩查、蛋白表達(dá)的差異,所研究的病理樣本來(lái)源患者之間互無(wú)遺傳學(xué)/血緣關(guān)系,所篩查出的基因不一定互有關(guān)聯(lián),也不能判斷篩出的相關(guān)基因變異是僅局限于肝臟組織,由HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生,還是在HCC發(fā)生前就已經(jīng)存在的?宿主遺傳
5、基因多態(tài)性對(duì)個(gè)體發(fā)生HCC的危險(xiǎn)度的影響?即具有那些遺傳背景的個(gè)體在慢性HBV感染情況下更易發(fā)生HCC。 研究目的: 把病毒學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)結(jié)合起來(lái),通過(guò)針對(duì)有肝癌家族史和無(wú)肝癌家族史的乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者匹配,探討β—catenin宿主基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,尋找β—catenin基因序列中是否存在HBV相關(guān)HCC遺傳學(xué)標(biāo)志—基因突變位點(diǎn)。 研究方法: 1、對(duì)符合病例入選標(biāo)準(zhǔn),不含
6、排除標(biāo)準(zhǔn)中因素的乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行家系和流行病學(xué)調(diào)查,從中挑選出有肝癌家族史的患者和與其流行病學(xué)因素一致但無(wú)肝癌家族史的匹配者共24例(包括12例有肝癌家族史病例和12例與之相匹配的無(wú)肝癌家族史病例)。病例外周血樣本進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)步驟。 2、從外周血液標(biāo)本中提取人基因組DNA。 3、針對(duì)β—catenin基因外顯子3(exon3)所在DNA片段設(shè)計(jì)并合成引物。 4、進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)
7、物目的條帶瓊脂糖凝膠中切膠和回收。 6、回收純化產(chǎn)物進(jìn)行的基因測(cè)序。 7、統(tǒng)計(jì)分析,比對(duì)測(cè)序結(jié)果和患者的家系調(diào)查結(jié)果。 研究結(jié)果: 對(duì)入選的24例患者進(jìn)行外周血中人DNA基因組提取后對(duì)目的片段進(jìn)行了擴(kuò)增,PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果在紫外線攝像儀照相可見目的條帶清楚,擴(kuò)增產(chǎn)物大小符合796bp,DNA提取和DNA擴(kuò)增的成功率達(dá)100%。切膠回收后在2%瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果樣本的雜帶已經(jīng)消失,呈現(xiàn)單一目的條帶且清
8、晰。24份樣本送基因測(cè)序均得到清晰的測(cè)序圖譜,樣本測(cè)序成功率為100%,得到各樣本所需研究分析的β—catenin基因exon3序列。 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)可見,所有患者在SNP rs28931588、rs28931589位點(diǎn)均為“G”。有3例患者(A8、A24、A23)測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站Genebank相關(guān)網(wǎng)頁(yè)顯示的序列存在多個(gè)位點(diǎn)的突變:A24 condons33,37和41;A8condons35,37,39,40,
9、41,43,44,45和46;A23 condons32,37,39,43。 研究結(jié)論: 1、本課題是首次專門在中國(guó)南方地區(qū)乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者中,通過(guò)有和無(wú)肝癌家族史患者匹配、由外周血提取人基因組DNA來(lái)研究該地區(qū)β—catenin的宿主基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感的關(guān)系。 2、乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者中,無(wú)論有或無(wú)家族史者,在SNP rs28931588、SNP rs28931589發(fā)生頻率都低,
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