乙型肝炎病毒對肝細胞表達免疫相關分子的影響.pdf

1、目的:
　　 1.檢測三種常見肝細胞系免疫相關分子的表達模式；
　　 2.比較不同復制水平的HBV 對不同肝細胞系天然免疫相關分子表達的影響；
　　 3.探索HepG2與HepG2.2.15細胞IL-10的表達差異及可能機制。
　　 方法:
　　 1.應用RT-PCR技術檢測不同肝細胞系（HepG2，HepG2.2.15，Huh7）免疫相關分子的表達情況。
　　 2.HBV 可復制質(zhì)粒pH

2、BV1.3和pBS-HBV1.3分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細胞，realtime RT-PCR檢測天然免疫相關基因TLRs、RLRs等的表達；CMIA 法檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清中抗原表達水平；real time RT-PCR檢測上清中HBV DNA水平。
　　 3.PCR及測序鑒定HepG2.2.15細胞中IL-10 mRNA的表達；ELISA 檢測進一步證實HepG2.2.15細胞上清中IL-10 蛋白的表達；在利用抗病毒干預處

3、理和HBVsiRNA、IL-10siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞后，real time PCR檢測細胞上清中HBV DNA及細胞IL-10 mRNA表達變化，CMIA 檢測HBsAg與HBeAg的表達，ELISA 檢測IL-10蛋白的表達。
　　 4.各種處理后real-time PCR、western blot 檢測STAT1、MyD88、NF-κB分子在HepG2.2.15細胞中的表達。
　　 結(jié)果:

4、　　 1.RT-PCR結(jié)果顯示：HepG2、HepG2.2.15、Huh7 三種肝細胞系能表達一系列的免疫相關分子，其中HBV 穩(wěn)定復制的HepG2.2.15細胞與HepG2 相比，表達上調(diào)的有：TGF-β1、IL-10、IL-10R、TNFR、HLA-A、MICB；而表達下調(diào)的有：IL-7、IL-15、IL-12p35、IL-15R、HLA-B、RIG1、A20、DUBA。其中有趣是IL-10 僅在HepG2.2.15細胞中檢測到表

5、達。
　　 2.不同可復制性HBV 克隆轉(zhuǎn)染不同肝細胞系后表現(xiàn)出不同的HBV 復制能力，pBS-HBV1.3 質(zhì)粒無論在HepG2 還是Huh7中其病毒DNA水平及抗原水平均明顯低于pHBV1.3 質(zhì)粒，且不同復制能力的HBV 對兩種肝細胞系天然免疫相關分子表達模式的影響也不一樣。
　　 3.HepG2.2.15細胞可以分泌表達IL-10，但pHBV1.3 瞬時轉(zhuǎn)染不能誘導HepG2表達IL-10，提示IL-10的表達可

6、能與HBV 瞬時表達無關而與HBV 持續(xù)復制相關。
　　 4.IL-10-siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15后，抑制了IL-10 蛋白及mRNA的表達，但對HBV的表達無明顯影響。
　　 5.HBVsiRNA 質(zhì)粒能抑制HepG2.2.15細胞系HBV 抗原及HBV DNA水平，但對HBV DNA的影響沒有統(tǒng)計學意義。HBVsiRNA 可下調(diào)IL-10的蛋白水平。
　　 6.拉米夫定可顯著降低HepG2.2.1

7、5細胞HBV 抗原表達及HBV DNA復制水平，同時下調(diào)IL-10的表達及mRNA 轉(zhuǎn)錄。但其它非特異性抗病毒免疫制劑的處理對HepG2.2.15細胞HBV DNA復制水平的影響均無統(tǒng)計學意義。除了poly(IC)升高IL-10的蛋白水平，其他處理不同程度的降低了IL-10的蛋白水平，但對NF-κB和MyD88的表達均沒有明顯影響。所有處理均影響STAT1的表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.HepG2、HepG2.2.15

8、、Huh7 三種肝細胞系能表達一系列的免疫相關分子，且不同肝細胞系的表達模式存在一定的差異，這些差異主要出現(xiàn)在HepG2細胞和HepG2.2.15細胞之間，而HepG2與Huh7 之間最大的差異是前者不表達TLR7，最有意思的是僅HepG2.2.15細胞檢測到IL-10的表達。
　　 2.HBV在肝細胞系中的復制影響了一些天然免疫相關分子的表達。pBS-HBV1.3質(zhì)粒在肝細胞系中的HBV 復制能力較pHBV1.3 低，不同程度

9、的HBV 復制對肝細胞系天然免疫相關分子表達的影響之間有一定的差異。
　　 3.HepG2.2.15細胞表達IL-10，但其表達和調(diào)控機制是不依賴于NF-κB、MyD88和HBV DNA水平的，STAT1 途徑可能參與了HepG2.2.15細胞中IL-10的表達調(diào)控，但并非唯一途徑?；罨疶LR3 途徑可能參與了該細胞系中IL-10的表達調(diào)控，但這種調(diào)控是不依賴于HBV DNA、NF-κB和MyD88的，其具體機制還需進一步研究。

10、
　　 本研究的創(chuàng)新點:
　　 1.以HepG2、HepG2.2.15和Huh7 三種常見肝細胞系為研究對象探討了免疫相關分子在肝細胞系的表達情況，并通過用不同復制能力的HBV 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同肝細胞系后檢測不同時間點的天然免疫相關分子表達變化，動態(tài)觀察了不同程度HBV 復制對肝細胞天然免疫相關分子表達模式的影響。
　　 2.發(fā)現(xiàn)常見肝細胞系中僅HBV 穩(wěn)定表達的HepG2.2.15細胞分泌表達IL-10，且HBV

11、瞬時表達不能誘導HepG2表達IL-10，并對這一重要免疫調(diào)控細胞因子在HepG2.2.15細胞系中表達的可能機制進行了初步研究。
　　 本研究的意義:
　　 1.初步探討了不同肝細胞系作為HBV 體外復制模型及不同程度HBV 復制對肝細胞系天然免疫相關分子表達影響的差異，為HBV 復制對肝細胞免疫分子表達影響的細胞模型的選擇提供了一定的依據(jù)，也為HBV 感染后肝臟免疫的可能機制提供了一定的依據(jù)。
　　 2.對I