乙型肝炎病毒X基因促進肝卵圓細胞增殖及其分子機制的研究.pdf

1、第一部分乙型肝炎病毒X 蛋白通過MEK/ERK和PI-3K/Akt信號通路上調cyclinD1 并促進肝臟卵圓細胞增殖
　　 第一節(jié) HBX在體外對肝臟卵圓細胞增殖的直接促進作用
　　 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X 蛋白在體外對肝臟卵圓細胞增殖的促進作用.
　　 方法：運用熒光顯微鏡觀察及Western blot 對穩(wěn)定表達HBX的大鼠肝臟卵圓細胞系HBX-EGFP-LE/6 進行鑒定。以轉染HBX細胞系HBX-

2、EGFP-LE/6 為實驗組，轉染標記綠色熒光蛋白空載體EGFP-LE/6、LE/6細胞系為對照組，通過MTT細胞增殖活力實驗及EDU 摻入實驗比較三組細胞DNA合成速度。
　　 結果：HBX在部分細胞克隆穩(wěn)定高表達，對照組細胞未檢測到HBX表達。HBX 對肝臟卵圓細胞的增殖具有促進作用，在同步化后培養(yǎng)24h、48h、72h，與對照組相比，HBX-EGFP-LE/6 卵圓細胞系增殖加快,差異有統計學意義。在血清刺激后，與對照組相

3、比，HBX-EGFP-LE/6 卵圓細胞系DNA合成加快,差異有統計學意義。
　　 結論：細胞內穩(wěn)定轉染并表達的HBX 蛋白對體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細胞的增殖具有直接促進作用，并且促進其S 期DNA合成。
　　 第二節(jié) HBX 對卵圓細胞周期蛋白表達的調控作用
　　 目的：研究HBX 對肝臟卵圓細胞中細胞周期調控蛋白表達水平的影響，探討HBX促進肝臟卵圓細胞增殖的分子基礎。
　　 方法：穩(wěn)定表達HBX基因的肝

4、臟卵圓細胞克隆為實驗組，表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細胞為對照組。Western blot 檢測細胞周期調控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達水平。
　　 結果：與對照組相比，cyclinD1的蛋白表達水平在HBX-EGFP-LE/6細胞中顯著上調，p27 蛋白的表達輕微下調。
　　 結論：HBX在肝臟卵圓細胞中影響細胞周期相關基因的蛋白表達水平，可能是其促進肝臟卵圓細胞增殖的分

5、子基礎之一。
　　 第三節(jié) HBX 對肝卵圓細胞MAPK 信號及AKT 信號的影響
　　 目的：研究HBX在卵圓細胞LE/6中對MAPK 通路信號的影響，探討HBX 促進LE/6卵圓細胞增殖的分子機制。
　　 方法：穩(wěn)定表達HBX基因的HBX-EGFP-LE/6 肝臟卵圓細胞為實驗組，表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細胞為對照組；Western blot 檢測了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK

6、、pAKT、p-JNK、p-p38在對照組與實驗組卵圓細胞內的表達水平。
　　 結果：與對照組比較，在HBX-EGFP-LE/6中，p-Erk、p-Akt的表達水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三種細胞中的蛋白表達水平沒有明顯變化。
　　 結論：胞內穩(wěn)定表達的HBX 蛋白可以在體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細胞中上調ERK、AKT信號。
　　 第四節(jié) HBX 上調cyclinD1表達并促進肝

7、臟卵圓細胞增殖依賴于HBX 上調的ERK 及AKT 信號
　　 目的：研究HBX 促進卵圓細胞增殖及上調cyclinD1是否依賴于HBX-EGFP-LE/6 內上調的ERK和/或AKT 信號。 方法：穩(wěn)定表達HBX基因的HBX-EGFP-LE/6 肝臟卵圓細胞為實驗組，表達綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細胞為對照組；運用特異性信號通路抑制劑LY294002，PD184352 阻斷卵圓細胞MEK/ERK及PI-3K/Akt

8、 信號轉導，然后在指定時間點westernblot 檢測cyclinD1在各組細胞中的表達情況; MTT 檢測阻斷干預72h后各組細胞的增殖活性。
　　 結果：抑制劑PD184352 阻斷通路72h后，干預組HBX-EGFP-LE/6細胞較未干預組細胞增殖活性降低，差異有統計學意義。抑制劑PD184352 阻斷通路72h后，干預組HBX-EGFP-LE/6細胞較未干預組細胞增殖活性降低,差異有統計學意義。HBX-EGFP-LE/

9、6細胞中的CyclinD1 蛋白高表達水平在兩種抑制劑分別作用后均不能維持。
　　 結論：HBX 上調的卵圓細胞增殖活性和CyclinD1表達水平，依賴于HBX 上調的ERK及AKT 信號。
　　 第二部分乙型肝炎病毒X蛋白通過影響TGFβ/smad 通路影響肝臟卵圓細胞增殖
　　 第一節(jié) HBX 降低肝臟卵圓細胞對TGFβ1 增殖抑制效應敏感性
　　 目的：研究卵圓細胞中HBX 蛋白對TGFβ1 增殖抑

10、制效應的影響。
　　 方法：HBX-EGFP-LE/6 卵圓細胞作為實驗組，LE/6和EGFP-LE/6 卵圓細胞作為對照組。運用Real-time和estern blot 檢測三組卵圓細胞中TGFβ受體2 mRNA及蛋白表達水平。MTT 試驗比較外源性TGFβ1在三組卵圓細胞中的增殖抑制效應。
　　 結果：TGFβ受體2在HBXEGFP-LE/6中的m RNA 及蛋白表達水平均下調。MTT表明外源性TGFβ1在對照組細

11、胞中具有更強的增殖抑制效應，差異有統計學意義。
　　 結論：HBX 影響卵圓細胞對TGFβ1 增殖抑制效應的敏感度，可能與TGFβ受體2的基因表達水平下調有關。
　　 第二節(jié)乙型肝炎病毒X 蛋白對卵圓細胞中smad2、smad3、smad4基因表達的調控作用
　　 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X 蛋白HBX 對肝臟卵圓細胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表達的調控作用。
　　

12、 方法：穩(wěn)定轉染HBX基因的大鼠卵圓細胞株HBX-EGFP-LE/6 作為實驗組，轉染綠色熒光蛋白標記空載體的大鼠卵圓細胞株EGFP-LE/6，大鼠卵圓細胞株LE/6 作為對照組檢測TGFβ/smad 信號通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表達情況。Real-time PCR檢測轉染細胞系HBX-EGFP-LE/6，以及對照組EGFP-LE/6，LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表達水平，weste

13、rn blot 檢測三組細胞中smad2、smad3、smad4 蛋白表達情況。
　　 結果：與對照組相比，穩(wěn)定轉染HBX基因的大鼠卵圓細胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的 mRNA 及蛋白表達水平未有顯著變化。Smad3、smad4的mRNA表達水平有顯著降低，Smad3 蛋白表達水平有一定程度降低，smad4 蛋白表達水平沒有顯著變化。
　　 結論：乙型肝炎病毒編碼X 蛋白可以在卵圓細胞中影響TGFβ/sm